骨髓间充质干细胞修复犬面神经缺损的实验研究

李阳等

摘要：目的 探讨实验研究骨髓间充质干细胞修复犬面神经缺损的效果，以更好的应用于临床研究。方法 选用8只成年当地犬，抽取骨髓液得到单个核细胞，经体外培养、纯化后获得骨髓间充质干细胞。犬的两侧面神经颊支分别造成平均25mm的缺损，一侧硅胶管套管连接后植入MSCs修复，另一侧单纯硅胶管套管修复。于术后第4、8、12、16w行大体观察，作组织学检查，，以评价神经再生恢复情况。结果 第4w时双侧管内未见明显再生神经纤维；第12，16w时，再生神经的有髓神经纤维计数，MSCs侧，均高于单纯套管侧，且差异显著（P<0.05）。结论 骨髓间充质干细胞可促进面神经缺损的修复，MSCs可应用于外周神经缺损的修复。

关键词：骨髓间充质干细胞；面神经缺损；神经再生

肿瘤术后或外伤等原因造成面神经缺损是口腔颌面外科临床经常遇到的问题。面神经缺损丧失严重影响面部功能与外形，不能完成正常的咀嚼、吞咽、语言活动，且面部外形异常，流涎；口角歪斜，眼睑闭合不全，额纹消失等。面神经修复的目的不仅是恢复面神经的连续性，维持患者正常的容貌形态，而且是为了恢复患者的咀嚼语言等功能。目前临床上采用各种修复方法，例如神经移植（耳大神经，腓肠神经等），套管法修复，但适应症常受到限制。

本实验主要采用体外分离、培养的犬骨髓间充质干细胞植入面神经缺损的硅胶套管内，使其能转化为雪旺细胞，促进面神经的修复，为修复神经损伤提供新的方法。

1资料与方法

1.1犬骨髓间充质干细胞的体外分离与培养[1～4] 成年（1岁以上）的当地犬8只，雌雄不限，骨髓穿刺针接5ml注射器，注射器内含稀释的肝素钠3 000 U 0.2 ml。从髂后上棘穿刺，抽取骨髓液4 ml，经PBS液1：3稀释后，以1：1缓慢注入预先加入密度为1.073 g/ml Percoll液的试管内，密度梯度离心，2 000 rpm，30 min，吸取中间的单个核细胞层，PBS液洗2次，以2×105/ml的浓度接种于50 ml培养瓶内，加5 ml L-DMEM液（含青霉素钠100 U/ml，链霉素100Lg/ml），加入胎牛血清终浓度为10%。在5%CO2孵箱内37℃培养4 d。更换培养液，将未贴壁的细胞弃除，以后每3 d换液一次。12～14 d后基本长满单层，用0.25%胰蛋白酶消化1～2 min，再用细胞刮子刮落贴壁细胞，即得到原代培养的MSCs悬液。再以8×104/mL的细胞浓度传代培养。取第3代MSCs植入缺损区的硅胶管内。

1.2面神经缺损模型制备 将成年犬用戊巴比妥钠麻醉，沿双侧下颌骨下缘上口角旁处切开，暴露并游离面神经颊支，因犬的面神经颊支在体表位置恒定，在无张力状态下居中切除平均25mm神经，在显微镜下用11-0无损伤缝合线与直径2 mm的硅胶管连接，对侧作为对照组。缝合时应避神经张力过大或扭曲，分层缝合手术切口。术后肌注青霉素80万U/d，连续3 d。

1.3 MSCs的植入 取体外培养的第3代骨髓MSCs，用含10%FBS的L-DMED制成细胞悬液，双侧面神经缺损模型形成自身对照，随机分为术后第4、8、12、16w 4组，每组2只。一侧单纯硅胶管连接面神经缺损；另一侧硅胶管套管内，注入MSCs悬液至充满套管。

2结果

手术后全部实验犬存活分别在4.8.12.16w取标本，大体观察4w时双侧管内未见明显再生神经纤维；8周时双侧硅胶管内见神经两端相互连接，中间区域神经较细；12w时双侧管内再生神经纤维增粗直径约神经干直径1/2，中间区域神经明显增粗；16w时双侧管内再生神经纤维增粗，直径约近端神经干直径1/2～2/3。HE染色结果示第12，16w时，再生神经的有髓神经纤维计数，MSCs侧，均高于单纯套管侧，且差异显著（P<0.05）。

3讨论

对周围神经损伤后修复的研究目前临床上多数为组织工程中的神经构建，大量基础研究集中在神经组织工程方面，它主要是根据周围神经解剖结构特点，通过分析神经再生微环境中各种细胞与生长因子之间的相互作用关系，重点研究雪旺细胞体外培养和植入。

雪旺细胞在神经再生中起重要作用，在外周神经损伤后，雪旺细胞分裂、增殖引导轴突生长，并能分泌10余种雪旺细胞源性神经营养因子，起到避免外周神经损伤后引起的神经元逆行性死亡，引导和促进轴突再生以及促进髓鞘形成的作用[5～8]。

MSCs（骨髓间充质干细胞）具有向多种细胞系分化的潜能，自体获取回输后不会发生免疫排斥反应.易于体外分离培养扩增.在体外可长时间保持未分化状态，体外基因转染率高.并能稳定高效表达多种治疗性外源目的基因，加上骨髓来源丰富，采集方便安全、损伤小，因此MSCs不仅是组织工程的重要种子细胞，还是研究细胞增殖分化的理想细胞模型，与其多向分化的潜能相结合，必将为组织器官缺陷性疾病、退行性疾病、遗传性疾病等治疗开辟广阔前景。

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编辑/许言