循环肿瘤DNA在恶性肿瘤诊疗中的应用

赵 晓 杜 楠 杨全胜

(解放军总医院第一附属医院， 北京 100048)

·综 述·

循环肿瘤DNA在恶性肿瘤诊疗中的应用

赵 晓 杜 楠 杨全胜

(解放军总医院第一附属医院， 北京 100048)

恶性肿瘤危害巨大，绝大多数患者明确诊断时已经是中晚期，预后差[1-2]。因此，建立一种方便、微创、灵敏、特异的诊断和监测手段势在必行。研究人员发现肿瘤是一种最常见的基因疾病，不同癌症有不同的诱因和症状，但都可以通过基因突变得到解释。循环肿瘤DNA是存在于血液中的细胞外游离DNA，具有无创、实时、可重复和操作简便等特点，通过对肿瘤患者循环肿瘤 DNA的动态监测，可能为患者的早期诊断、用药选择、病情监测提供全面的实时信息。本文对近年来国内外有关循环肿瘤DNA及其在恶性肿瘤诊疗中应用的研究综述如下。

1 循环肿瘤 DNA

循环DNA是一种存在于血浆或血清、脑脊液及滑膜液等体液中的细胞外 DNA。肿瘤患者外周血中存在的循环DNA，含量明显高于健康人，并且这些循环 DNA具有肿瘤特征性，称为循环肿瘤DNA[3]。循环肿瘤DNA极易获得，在恶性肿瘤发生的早期其含量和基因的异常改变就可以被检测到。而且它携带有肿瘤患者的基因信息，定量或定性分析这些循环 DNA对肿瘤的早期诊断、治疗、病情监测及预后的评价都具有重要意义。更重要的是能够为肿瘤个体化治疗提供较全面的分子学特性，是一种理想的肿瘤标志物[4]。

1.1 循环肿瘤 DNA的来源 研究发现，在原发肿瘤形成和生长的各个阶段都会出现肿瘤细胞的坏死和凋亡, 无论肿瘤细胞是原位死亡或是进入循环系统，它们的DNA都会释放入血液[5]。关于循环肿瘤 DNA 具体的释放机制仍存在争论，通过近年的研究，人们推测其主要可能来源于以下一些途径：①循环血或微转移灶中肿瘤细胞溶解；②肿瘤细胞的坏死或凋亡；③肿瘤细胞不断释放DNA进入血液循环；④肿瘤侵袭致周围细胞、组织变性而释放DNA入血；⑤肿瘤分泌的小囊泡——exosome中存在的DNA，即exDNA，其意义尚不清楚。但是，无论循环肿瘤DNA如何产生，目前研究都认为，它与原发肿瘤的基因组 DNA具有相同的遗传变异，其变异特征和表达量都与原发肿瘤组织呈正相关，并能反映肿瘤的特征性改变。对这种肿瘤DNA的替代物的回收和检测，为肿瘤的诊断和预测开辟了新领域。

1.2 循环肿瘤 DNA的特点 恶性肿瘤患者循环肿瘤 DNA含量较正常人群增高，完整性较好，并且一个癌细胞克隆群落中的每一个突变共同组成了独一无二的突变信息“条形码”，对肿瘤患者循环DNA的分析被认为是实时的“液相活检”。通过提取患者血浆中循环肿瘤 DNA获取肿瘤的全部片段，而不是对肿瘤的某一特殊部位进行组织活检，可以体现出患者疾病的大致轮廓，从而评估患者当前肿瘤的所有突变和克隆情况[6]。同时，相对于传统组织活检创伤大、标本量小等局限性，循环DNA具有取样简便易行，患者痛苦小等优势，是一种十分理想的检测标本。借助现代分子生物学手段对循环游离DNA进行提取，并对其遗传学和表观遗传学的异常改变进行分析，可能为肿瘤的早期诊断、疗效评估、复发监测及预后判断提供重要的信息，这种基于血液样本分析的研究方法正在成为肿瘤领域的研究热点。

2 循环肿瘤DNA的检测

对循环肿瘤DNA的检测可分为定性和定量两种：前者主要检测血清和血浆中肿瘤特异性基因的改变，后者则检测血清和血浆的DNA总量。早期研究方法有4类：RNA-DNA 杂交法、二苯胺法、溴化乙锭法和对流免疫电泳法，它们技术方法不同，但都有一定的缺陷，特别是在判定检测方法的金标准上，表现欠佳，敏感度和特异度均不十分理想。近年来，以分子生物学的迅速发展为起点，又有一批新的研究方法产生，在临床上得到了广泛的应用，如单核苷酸多态性分析、放射免疫法、分光光度测量法、实时定量PCR法、荧光定量法等，大大提高对循环肿瘤 DNA 检测的灵敏度[7]。近年来出现的新一代测序法，具有成本低、速度快、通量高的特点，在肿瘤临床领域显现出很高的应用价值。

2.1 定量检测 既往对于循环肿瘤 DNA的定量检测缺乏统一标准，曾经通过显色反应结果，根据颜色与浓度的对应关系检测其浓度，但其灵敏度和特异度不高，未能在临床上大规模开展。之后又陆续出现了血清凝集素抑制法、补体结合法等一些新的检测方法，但灵敏度仍较低。近年来，随着放射免疫分析和对流免疫电泳技术的发展，DNA检测灵敏度有了较大的提高，可以检测纳克级(ng)的DNA[8]，而实时定量 PCR技术出现之后，更是可以检测皮克(pg)级的 DNA。除此之外，还有一些改进技术或联合应用技术可以更加精确地测定循环DNA的含量。近年，多项研究发现，在治疗过程中，检测到的循环肿瘤DNA数量跟肿瘤容积有关联，

而治疗后，确认的患者与残留病体相符合，并且相比放射治疗手段，该方法的检测反应更佳。

2.2 定性分析 循环肿瘤DNA 的定性分析是指对肿瘤特异性基因改变的检测。理论上，任何肿瘤相关的遗传学和表遗传学改变均可以用来进行检测。而目前临床上，主要开展的检测包括基因突变、甲基化异常、微卫星不稳定性(MSI)和杂合性缺失(LOH)等，如对K-ras 和p53 基因突变的检测。实时定量PCR技术精度较高，曾经是定性分析循环肿瘤 DNA的主流技术。

2.3 新一代测序 循环肿瘤DNA的快速发展离不开测序技术的不断进步，近几年来，基因测序领域技术发展迅速，通过对DNA直接测序就可以鉴别循环DNA的突变信息，大大缩短了检测的时间和经济成本，利用血液样本替代组织进行基因突变检测成为现实[9]。其中新一代测序是二者发展史上的里程碑，在这里进行简单介绍[10]。 新一代测序(NGS)又称二代测序、高通量测序或大规模平行测序(MPSS)，是相对于第一代测序即桑格测序(Sanger sequencing) 而言的。

2005年罗氏公司推出了第一台高通量测序仪，其后罗氏公司和Illumina 公司相继推出了Solexa 基因组分析仪，ABI 公司推出了SOLiD 测序仪，3类测序平台虽然各有特点，但都以高输出量与高解析度为特性，在原理上也有许多共同之处：三者都是将目标DNA剪切为小片段，然后将单个小片段DNA分子结合到固相表面，对单分子独立扩增，而且每次只复制一个碱基(A、C、T、G)并检测信号，最后通过高分辨率的成像系统获取测序结果。NGS仅用了短短的10年时间就成功地从科学研究转化为临床应用，目前在无创产前诊断、单基因遗传病诊断、器官移植排斥筛查以及肿瘤相关基因的检测方面发挥出巨大的应用价值。

NGS较第一代测序在肿瘤诊断方面表现出超高的敏感性和特异性，原因主要有两个。首先，多基因组合大大提高了对肿瘤诊断的敏感性和特异性：传统的第一代测序只能一个基因、一个基因地进行检测，而NGS技术能对多个基因同时进行检测。其次，NGS技术本身检测基因突变的灵敏度就高于第一代测序。目前公认的第一代测序检测突变的灵敏度大约在20%，而NGS技术由于引入了测序深度(sequencing depth) 这一概念，使其可以检测到低于0.5%的突变。测序深度是指测序得到的碱基总量(bp) 与目的基因组大小的比值，是评价测序量的指标之一。测序深度越深，对突变检测的灵敏度也越高。另外，NGS 还能检测血浆中循环肿瘤DNA的甲基化状态和拷贝数变异等。

NGS技术中刚刚兴起的单细胞测序技术也在肿瘤诊断中显示出广阔的前景。单细胞测序技术是将分离的单个细胞中微量的全基因组DNA 进行无选择性地扩增，获得高覆盖率的完整的基因组之后再通过NGS 技术对其进行测序，从而揭示细胞个体间差异。值得一提的是，2012 年，华大基因同样利用单细胞测序技术分析了单个肾癌细胞的单核苷酸突变特征，从而在更高的分辨能力上为评价基因改变的复杂性提供了更为优化的方法[8]。2014 年，他们又用该方法在结肠癌中发现了一个新的癌基因SLC12A5[9]。单细胞测序技术还能与循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs) 筛选技术相结合，检测外周血CTCs 单核苷酸变异(single-nucleotide variations，SNV)、基因拷贝数变异(copy number variations，CNV)或外显子组插入/缺失突变，为肿瘤诊断及个体化治疗提供一种非侵入性检测手段。

NGS的发展极大促进了循环肿瘤DNA在肿瘤诊断中的应用，但是在临床应用中仍有很多问题需要解决，如数据在临床诊断上的作用、测序数据的储存和分析、数据的安全和信息隐私等。

3 循环肿瘤DNA 的临床应用

人类早在1947年就发现了循环核酸，并在30 年后开始对肿瘤患者血液循环中的循环DNA进行研究。近几年，随着现代分子生物学技术的迅速发展，通过对循环肿瘤DNA检测可以在较短时间内获得多个基因的表达水平、突变信息等情况，使得循环肿瘤DNA在肿瘤的诊断和治疗监测中的应用有了新的突破，利用血液样本替代传统组织进行基因检测有望成为现实。

3.1 早期诊断 循环肿瘤DNA 水平变化与恶性肿瘤的临床筛查方面的研究开展较早，早期研究聚焦于恶性肿瘤患者循环肿瘤DNA含量与正常人之间的差异。1997年关于癌症患者血清中存在的游离 DNA 含量约为健康人的 10 倍的报道，引发了研究人员对血循环中游离 DNA 与恶性肿瘤相关研究的普遍关注。后续多项研究相继证实，在结肠癌、肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤患者外周血中的循环肿瘤DNA含量与正常人存在明显差异。在恶性肿瘤血行转移方面，有研究发现：伴有远处转移的患者循环肿瘤DNA水平明显高于无远处转移的患者，提示循环肿瘤DNA可能作为血行转移重要的预测指标。另有报道肿瘤循环DNA水平与临床分期、转移情况及肿瘤大小具有相关性，可以作为乳腺癌的诊断、分期指标[11]。近年来越来越多的研究关注循环肿瘤DNA 中的基因突变，如检测非小细胞肺癌患者EGFR基因突变，进一步对不同恶性肿瘤患者从基因水平上进行个体化诊断分析[12]。这些研究视野的拓展和新发现，为肿瘤的早发现、早诊断提供了新的思路和方法。

3.2 疗效预测 近年来，有关循环肿瘤DNA水平变化与抗肿瘤(包括手术、放疗、新辅助化疗、姑息性化疗等)疗效预测方面的研究陆续出现。在循环肿瘤DNA 水平变化与手术治疗疗效预测方面，Sozzi等[13]在对术后肺癌患者的随访中发现，无复发患者循环肿瘤DNA水平逐渐恢复正常，而复发患者出现2～20 倍的增加；Banki等[14]在对食管癌术后患者进行随访研究发现，术后循环肿瘤DNA 水平降至正常患者，中位生存期12 个月时复查病情稳定，无明显复发、 转移征象，而循环肿瘤DNA水平上升患者出现了疾病的复发和进展。国内也有系统性研究发现，肺癌、结肠癌等发生复发转移时外周血循环DNA 的含量明显增高[15]。上述的研究主要从循环肿瘤DNA整体水平变化进行探讨，近年来随着分子生物学研究的深入，针对与疾病关系明确的DNA 片段进行定性分析成为新的研究主体。其中，基因突变检测中应用较为广泛的如K-ras 基因，可以为结、直肠癌患者化疗是否联合西妥昔单抗提供疗效预测标志；EGFR基因外显子 19 和 21 的突变情况开始进入临床为非小细胞肺癌分子靶向治疗疗效预测提供实验依据。ERCC1、TYMS、UGT等基因多态性分析也正在研究阶段，预计将为肿瘤个体化治疗提供实验依据。

3.3 个体化治疗 过去10年，对于恶性肿瘤发生、维持和进展的关键驱动分子方面的研究取得了重大进展，这些新发现促成了新型治疗策略的突破[16]。肿瘤患者的临床处理正在从基于患者临床特征选择治疗方案的传统治疗模式，转变为基于患者肿瘤分子表达谱选择治疗方法的个体化治疗模式。这种全新的医疗模式以个人基因组信息为基础，结合蛋白质组、代谢组等相关内环境信息，为患者量身设计出最佳治疗方案，选择合适的药物及正确的剂量，预测药物的疗效，在癌症治疗中已经初见成效，正在世界范围内逐步取代现在的肿瘤治疗模式[17]。这种治疗模式的推广，对于肿瘤监测提出了新的要求，促使临床工作者寻找更为高效、准确的肿瘤监测手段来判断患者病情发展变化及对治疗的反应。近几年来，基因检测技术的发展和完善提高了其检测结果的可信度，检测设备和检测成本的下降为这一技术的广泛应用提供了可行性。这些发展都为我们开展以基因检测为基础的肿瘤监测提供了可能性。

有最新研究报道，循环肿瘤 DNA在肿瘤个体化治疗中的作用已经在一些转移性乳腺癌，转移性结、直肠癌和转移性黑色素瘤的研究中得到证实[18-19]。研究发现，通过连续监测转移性乳腺癌患者循环肿瘤DNA的 10个伴随突变，针对不同亚克隆肿瘤灶给予不同的化疗方案，患者治疗效果显示出明确差异。对转移性结、直肠癌患者经KRAS等位基因突变检查诊断后给予抗EGFR抗体药物治疗，经影像学检查证实为疾病进展的平均时间为21周，最长可达10个月[20]。德国的研究者们对复发性胃肠道间质瘤患者血浆标本的循环肿瘤DNA的突变情况与患者的临床状态进行了匹配，发现两者具有较好的相关性[21]。先前研究表明，肺癌患者循环肿瘤DNA水平比对照组人群的水平更高，循环肿瘤DNA可作为接受化学治疗患者疾病进展的显著预测标志物[22]。此外，另一些研究报道了循环肿瘤DNA水平和患者预后之间的相关性。虽然仅是初步研究，但这些结果仍然显示通过监测循环肿瘤DNA，有助于我们在影像学证据出现以前，针对新生转移性肿瘤灶进行早期干预。这些发现表明：在不久的将来，循环肿瘤DNA可能被用于高风险人群的筛查、患者的预后评估和疗效评价，其广泛的应用性和潜在的重要性将对临床工作产生更大的影响。

4 小结与展望

循环肿瘤 DNA 可以直接从患者的外周血中获取，有望发展成为一种新型的肿瘤学监测指标。作为一种灵敏、特异、无创的分子生物学检测手段，检测循环肿瘤DNA可以便捷地对肿瘤做出早期诊断、进行疗效监测及对恶性肿瘤做出预后评价，可应用于肿瘤的预防以及个体化治疗的开展。

但是目前，各中心对于循环肿瘤DNA的研究方法和研究结果不尽相同。循环肿瘤DNA检测如何作为一种标准化的方法应用于临床？这就亟需建立一套国内外统一的循环肿瘤DNA定量检测标准以及各类型肿瘤定性分析的谱式，为将来开展大规模的流行病学监控、系统地收集癌症患者外周血标本、规范循环肿瘤DNA的临床应用奠定基础。另外，现代DNA测序技术尤其是二代测序技术敏感性极高，这也增加了检测的非特异性，即假阳性。这类技术在肿瘤临床中的应用，除了需要完备的质量控制和系统的临床样本对比外，还需重新审视现有临床意义明确的基因的临床指导价值。因此，循环肿瘤DNA在临床中的广泛应用还需要大规模临床试验的验证。

[1] Newman AM, Bratman SV, To J, Wynne JF, Eclov NC, Modlin LA, Liu CL, Neal JW, Wakelee HA, Merritt RE, Shrager JB, Loo BW, Jr., Alizadeh AA, Diehn M. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage [J]. Nature medicine, 2014, 20(5): 548-554.[2] Fujiwara K, Fujimoto N, Tabata M, Nishii K, Matsuo K, Hotta K, Kozuki T, Aoe M, Kiura K, Ueoka H, Tanimoto M. Identification of epigenetic aberrant promoter methylation in serum DNA is useful for early detection of lung cancer [J]. Clin Cancer Res, 2005, 11(3): 1219-1225.

[3] Rosell R, Molina MA, Serrano MJ. EGFR mutations in circulating tumour DNA[J]. Lancet Oncol, 2012, 13(10): 971-973.

[4] Bryzgunova O, Bondar A, Morozkin E, Mileyko V, Vlassov V, Laktionov P. A reliable method to concentrate circulating DNA [J]. Analytical Biochem, 2011, 408(2): 354-356.

[5] Alix-Panabieres C, Schwarzenbach H, Pantel K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA [J]. Annual Rev Med, 2012, 63(2):199-215.

[6] Leary RJ, Sausen M, Kinde I, Papadopoulos N, Carpten JD, Craig D, O’shaughnessy J, Kinzler KW, Parmigiani G, Vogelstein B, Diaz LA, Jr., Velculescu VE. Detection of chromosomal alterations in the circulation of cancer patients with whole-genome sequencing [J]. Sci Translational Med, 2012, 4(1): 152-154.[7] Hong B, Zu Y. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends[J]. Theranostics, 2013, 3(6): 377-394.

[8] Azvolinsky A. Beyond counting: new way to use circulating tumor cells [J]. J National Cancer Institute, 2014, 106(10):1005-1008.

[9] Auer M, Heitzer E, Ulz P, Geigl JB, Speicher MR. Single circulating tumor cell sequencing for monitoring [J]. Oncotarget, 2013, 4(6): 812-813.

[10] Cooke S, Campbell P. Circulating DNA and next-generation sequencing [J]. Recent Results Cancer Res,2012, 195:143-149.

[11] Madhavan D, Wallwiener M, Bents K, Zucknick M, Nees J, Schott S, Cuk K, Riethdorf S, Trumpp A, Pantel K, Sohn C, Schneeweiss A, Surowy H, Burwinkel B. Plasma DNA integrity as a biomarker for primary and metastatic breast cancer and potential marker for early diagnosis [J]. Breast Cancer Res Treatment, 2014, 146(1): 163-174.

[12] Douillard JY, Ostoros G, Cobo M, Ciuleanu T, Cole R, Mcwalter G, Walker J, Dearden S, Webster A, Milenkova T, Mccormack R. Gefitinib treatment in EGFR mutated caucasian NSCLC: circulating-free tumor DNA as a surrogate for determination of EGFR status [J]. J Thoracic Oncol, 2014, 9(9): 1345-1353.

[13] Sozzi G, Conte D, Mariani L, Lo Vullo S, Roz L, Lombardo C, Pierotti MA, Tavecchio L. Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients [J].Cancer Res, 2001, 61(12): 4675-4678.

[14] Banki F, Mason RJ, Oh D, Hagen JA, Demeester SR, Lipham JC, Tanaka K, Danenberg KD, Yacoub WN, Danenberg PV, Demeester TR. Plasma DNA as a molecular marker for completeness of resection and recurrent disease in patients with esophageal cancer [J]. Arch Surg, 2007, 142(6): 533-538; discussion 538-539.

[15] 闫巍，张能维，徐智，阿民布和，朱斌，宫轲，尹刚，孙志鹏. 结直肠癌患者手术前后循环DNA 水平的变化及其意义 [J]. 中国普通外科杂志, 2013, 22(12): 1627-1630.

[16] Dobbelstein M, Moll U. Targeting tumour-supportive cellular machineries in anticancer drug development [J]. Nature Rev Drug Discovery, 2014, 13(3): 179-196.

[17] Aparicio S, Caldas C. The implications of clonal genome evolution for cancer medicine [J]. New Engl J Med, 2013, 368(9): 842-851.

[18] Newman AM, Bratman SV, To J, Wynne JF, Eclov NC, Modlin LA, Liu CL, Neal JW, Wakelee HA, Merritt RE, Shrager JB, Loo BW, Jr., Alizadeh AA, Diehn M. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage [J]. Nature Med, 2014, 20(5):548-554.[19] Bidard FC, Madic J, Mariani P, Piperno-Neumann S, Rampanou A, Servois V, Cassoux N, Desjardins L, Milder M, Vaucher I, Pierga JY, Lebofsky R, Stern MH, Lantz O. Detection rate and prognostic value of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in metastatic uveal melanoma [J]. Intern J Cancer, 2014, 134(5): 1207-1213.

[20] Mcbride DJ, Orpana AK, Sotiriou C, Joensuu H, Stephens PJ, Mudie LJ, Hamalainen E, Stebbings LA, Andersson LC, Flanagan AM, Durbecq V, Ignatiadis M, Kallioniemi O, Heckman CA, Alitalo K, Edgren H, Futreal PA, Stratton MR, Campbell PJ. Use of cancer-specific genomic rearrangements to quantify disease burden in plasma from patients with solid tumors [J]. Genes Chromosomes Cancer, 2010, 49(11): 1062-1069.[21] Maier J, Lange T, Kerle I, Specht K, Bruegel M, Wickenhauser C, Jost P, Niederwieser D, Peschel C, Duyster J, Von Bubnoff N. Detection of mutant free circulating tumor DNA in the plasma of patients with gastrointestinal stromal tumor harboring activating mutations of CKIT or PDGFRA [J].Clin Cancer Res,2013, 19(17): 4854-4867.

[22] Catarino R, Coelho A, Araujo A, Gomes M, Nogueira A, Lopes C, Medeiros R. Circulating DNA: diagnostic tool and predictive marker for overall survival of NSCLC patients [J]. PloS One, 2012, 7(6): e38559.

10.3969/j.issn.1672-8521.2015.01.016

解放军总医院临床科研扶持基金(304专项)资助(2014FC-CXYY-1004)

2014-12-08)