突破衍射极限——探索纳米世界的超分辨显微技术

李德增+陈波

摘要：介绍了2014年诺贝尔化学奖，并以此为背景围绕着如何突破衍射极限提高分辨率这一核心问题，通过衍射极限产生的原因、突破的途径及新型显微技术发展的历程及特点等几个方面展开阐述，以期更好地认识新型光学显微技术在探索纳米世界时的作用和意义。

关键词：诺贝尔化学奖；衍射极限；瑞利判据；超分辨率；荧光显微技术

文章编号：1005–6629（2015）1–0012–05 中图分类号：G633.8 文献标识码：B

1 引言

2014年10月8日，2014年度诺贝尔化学奖揭晓，美国科学家埃里克·白兹格（Eric Betzig）、威廉姆·艾斯科·莫尔纳尔（William E. Moerner）和德国科学家斯特凡·W·赫尔（Stefan W. Hell）三人获奖，以表彰他们在超分辨率荧光显微技术领域取得的成就。

长期以来，光学显微镜的分辨率被认为是有极限的，它不可能超过二分之一个光波长度，对于可见光波长而言，约200纳米。1873年德国物理学家阿贝（E. Abbe）指出衍射极限是传统光学显微镜存在最大分辨率的物理限制。然而，在荧光分子的帮助下，今年诺贝尔奖化学奖的几位获得者巧妙地绕开了这种限制，并突破了这一极限。他们划时代的贡献将传统光学显微镜技术带进了纳米领域，使光学显微镜步入了纳米时代。

根据纳米荧光显微技术，科学家实现了活体细胞中单个分子通路的可视化。他们能够观察到分子是如何在大脑神经细胞之间生成神经突触；还可以追踪帕金森病、阿尔兹海默症和亨廷顿症患者体内相关蛋白的累积情况等等。然而科学家在最小分子水平上对活体细胞细节进行研究时，却受到了限制。由于今年三位诺奖得主的贡献，我们可以利用突破衍射极限的光学显微镜对纳米世界一探究竟。

这次获奖的是两项独立的技术。第一项是Stefan Hell于2000年研制的受激发射损耗（STED）显微技术。此项技术采用了两束激光。一束负责激发荧光分子使其发光，另一束则负责抵消大部分荧光，只留下一块纳米大小体积的荧光区域。用该技术仔细扫描样本，得出的图像分辨率打破了Abbe提出的显微分辨率极限。Eric Betzig和William Moerner分别独立地进行研究，为第二种技术即单分子显微技术打下了基础。这种方法依赖于开关单个分子荧光的可能性。科学家对同一区域进行了多次“绘图”，每次仅仅让很少量的分散分子发光。将这些图像叠加起来产生了密集的纳米尺寸超分辨率图像。2006年，Eric Betzig首次采用了这一技术[1]。

今天，超分辨纳米显微技术已被世界广泛采用，新知识源源不断地产生，造福着人类。利用超高分辨率显微镜，可以让科学家们在分子水平上对活体细胞进行研究，如观察活细胞内生物大分子与细胞器微小结构以及细胞功能如何在分子水平上进行表达及编码，对于理解生命过程和疾病发生机理具有重要意义。

本文围绕着如何突破分辨率极限这一核心问题，通过分辨率极限产生的原因、突破的途径及新型显微技术发展的历程及特点等几个方面展开阐述，以期更好地理解新型光学显微技术在探索纳米世界时的作用和意义。

2 衍射极限与瑞利判据

传统（透镜式、传输光）光学显微镜的有效放大倍率是有限的，它取决于成像的衍射极限。光在传播过程中，遇到障碍物或小孔时，光将偏离直线传播的途径而绕到障碍物后面传播，即光的衍射现象。衍射效应使障碍物后空间的光强重新分布，使得一切几何影界失去了明锐的边缘。衍射极限是指一个理想物点经光学系统成像，由于衍射的限制，系统所成的像不再是理想的几何点像，而是得到形成明暗相间的衍射图样（夫朗和费衍射像）。许多成像光学仪器就是一个低通滤波器，物平面包含从低频到高频的信息，透镜口径限制了高频信息通过，只许一定的低频通过，因此，丢失了高频信息的光束再合成，图像的细节变模糊。这是显微镜分辨率受到限制的根本原因。因为一般光学系统的口径都是圆形，大约有84%的光能量集中在中央亮斑，即爱里斑（Airydisk）（图1a），这样每个物点的像就是一个弥散斑。当两个物点过于靠近，其弥散斑重叠在一起，就可能分辨不出是两个物点的像，这样就限制了系统的分辨率，这个斑越大，分辨率越低。这个限制是物理光学的限制，是光的衍射造成的，即光学系统中存在着一个分辨极限。

Abbe用衍射理论预言了分辨率极限的存在[2]，这个分辨极限通常采用瑞利（Rayleigh）提出的判据[3]：当一个爱里斑的中心与另一个爱里斑的第一级暗环重合时，两个爱里斑像就可分辨或恰可分辨，如图1b所示。如果两个爱里斑的中心间距小于爱里斑的半径（图1c），两个爱里斑像就不能分辨。对于显微镜物镜，锥形光束聚焦的焦斑最小可分辨尺度设为CD，则：

3 突破衍射极限

阿贝推导的传统光学显微镜成像中的衍射极限，与海森伯不确定性原理同为物理学中的两大著名的物理极限定理。用海森伯原理可说明光子发射不确定性，因而也可说明限制传统光学显微镜分辨极限的关键所在和突破光学显微镜分辨极限所要求的条件。

4 打破衍射极限：近场光学显微技术

当光源照射到物体表面时，在物体表面的场分布可划分为两个区域：一部分是从近场区域至无穷远称为远场；另一部分是物体表面小于一个波长（或λ/2）尺度范围内的区域，称为近场。近场光学之所以能突破衍射极限成像，其核心问题是依赖于对隐失波的探测，这是实现超分辨成像的关键。其原理是采用亚波长尺度的探针在距离样品表面几个纳米的近场范围进行扫描而将隐失场转换成忠实地复制隐失场局域的剧烈变化的传播场，并导向合适的远端探测器进行分析。近场光学显微镜（NOM）可粗分为两大类型：扫描近场光学显微镜（SNOM）和光子扫描隧道显微镜（PSTM）。基于近场光学技术的光学分辨率可以达到纳米量级，这将为科学研究的诸多领域，尤其是纳米科技的发展提供有力的操作、测量方法和仪器系统。

1928年，英国的辛格（Synge EH）[5]和1956年奥·基夫（Okeefe JA）先后独自提出了概念设计。60年代，工作在微波区域的近场显微镜，由E. A. Ash和G. Nichols研制成功，在人类历史上第一个制成了突破衍射极限的显微镜。1982年，瑞士苏黎世IBM的G. Binning和H. Rohrer等[6]发明的扫描隧道显微镜（STM），在被应用到光学领域时，极大推动了近场光学显微镜的诞生和发展。1984年，瑞士苏黎世IBM的D. W. Pohl等人[7]利用微孔径作为微探针制成第一台扫描近场光学显微镜，首次实现了可见光波段显微镜分辨极限的突破。1986年，美国康奈尔大学的E. Betzig等[8]制成改进的近场光学显微镜。1989年R. C. Reddick等人[9]研制成了另一类突破分辨率衍射极限的光学显微镜——光子扫描隧道显微镜（PSTM）。1991年，E. Betzig等人[10]对近场扫描光学显微镜进行重大技术改进。随后，各种各样的近场光学显微镜逐渐走向成功，开始应用于表面超精细结构的光学现象观测校样[11]。

5 绕开衍射极限：超分辨率荧光显微技术

近场光学显微技术实现了衍射极限的突破，但由于其制备工艺及观察活细胞和细胞膜的动态变化过程中的限制，探索既具有亚微米甚至纳米尺度的光学分辨本领，又可以连续监测生物大分子和细胞器微小结构的演化，而并不影响生物体系的生物活性和新型超分辨显微技术显得尤为重要。近年来，随着新型荧光分子探针的出现和成像方法的改进，可以在活细胞上看到纳米尺度的蛋白质。这些技术上的进步势必极大地推动生命科学的发展。

本年度诺贝尔化学奖即是对两项独立的超分辨率荧光显微技术的肯定。在这里首先介绍单分子显微技术。通过确定单个荧光分子位置的精度的提高，可以很容易超过光学分辨率的极限，达到纳米级[12]。在此基础上，人们开始测量一些荧光标记生物分子的纳米级定位和运动。1981年，Barak和Webb[13]首先将单分子跟踪技术引入到生命科学中，在成纤维细胞上跟踪了一个荧光标记的低密度脂蛋白受体的动力学过程。2006年Eric Betzig[14]提出了光激活定位显微技术（Photo Activated Localization Microscopy，PALM）的概念。应用单分子荧光成像的定位精度，结合这种荧光蛋白的发光特性，突破了光学分辨率的极限。如图6所示，（A，A′）为未激活任何感光荧光蛋白分子（PA-FP）时；（B，B′）为用405nm的激光激活了4个荧光分子；（C，C′）为用488nm的激光观察一段时间后漂白了第一轮激活的4个荧光分子；（D，D′）为第二轮重新激活的另外的几个荧光分子；（E，E′）为两轮激活的荧光分子总和组成的图像；（F，F′）为E图的局部放大。PALM显微镜的分辨率仅仅受限于单分子成像的定位精度，理论上来说可以达到1nm的数量级。2006年美国霍华德-休斯研究所的华裔科学家庄晓薇[15]实验组开发出来一种类似于PALM的方法：随机光学重构显微技术（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM），推进了此领域的研究进展。

尽管单分子的定位精度可以达到纳米级，但它并不能提高光学显微镜在分辨两个或者多个点光源时的分辨率。不管是PALM还是STORM的超分辨率成像方法，其点扩散函数（Point-spread Function，PSF）成像仍然与传统显微成像一致。相对近场光学显微技术来说，是一种绕过衍射极限的超分辨方法。

2000年，德国科学家Stefan Hell[16，17]开发了另一种超高分辨率显微技术，其基本原理是通过物理过程来减少激发光的光斑大小，从而直接减少点扩散函数的半高宽来提高分辨率。当特定的荧光分子被比激发波长更长的激光照射时，可以被强行猝灭回到基准态[18]。利用这个特性，Hell等开发出了受激发射损耗显微技术（Stimulated Emission Depletion，STED）。其基本的实验过程如图7所示，紫色代表的是激发激光，黄色代表的是用来受激发射损耗的激光，两束激光经过时间空间调制后同时照射在样本上。由图中可以看出，激发光光斑（紫色）经STED激光（黄色）的调制后极大地减少了激发的荧光分子的光斑大小（绿色），其半高宽可以达到66nm，运用该技术进行样品观察探测，即可得出突破衍射极限的超分辨率图像。

6 结语

人们对于未知世界的探索是无止境的。起初，人类关于周围世界的观念局限在用肉眼，或者靠手持透镜帮助肉眼所看到的东西。然后，人类的认识并不局限于此，有太多未知世界的奥秘激励着人们去探求，四季轮回，斗转星移，对人类来说，都是那么神秘。当伽利略于几百年前第一次把自制的望远镜对向浩瀚的太空，他的脑海里一定满是震惊，一个新的世界展现在他的视野里，也把人类的目光延伸到了数以光年计的宏观领域。而同时人类也把目光投向了另一个未知的世界，一个尺寸小于人眼所能辨别的领域——微观领域。这要归功于另一个伟大的发明——显微镜——它同样在人类的视野里展现了一个全新的世界，第一次看到了数以百计的“新的”微小动物和植物，以及从人体到植物纤维等各种东西的内部构造，至今仍令人着迷。后来，慢慢地发现通过普通的光学显微镜所能分辨的尺寸有着一个极限，无论如何设计这个极限都是无法逾越的。这时，阿贝给出了极限存在的科学解释，瑞利给出了判据，并进而激发了人们去突破这个极限。分辨率有着质的飞跃的是用电子和离子作信息载体的显微镜，如扫描电子显微镜、扫描隧道显微镜和场离子显微镜等。虽然分辨率在提高，但却未真正地突破衍射极限。直到充分认识到近场隐失波的物理意义，并制备出近场显微镜，才真正地突破了衍射极限。随之，各种各样的近场显微技术出现并探索着纳米尺度的微小世界。而在认识生命相关的生物动态变化过程中，激发人们去寻求一种兼具微尺度要求及生物活性的新的显微技术。超分辨率显微镜成像技术的出现、应用和进一步完善，将使得科学家实时动态观察生物有机体内的生化反应过程成为现实，为深刻认识复杂生命现象的本质打开了一扇窗。人类探索的步伐定会继续进行下去，在更微观的世界里去更好地认识事物的本质、变化规律及作用机制，进而根据认识的规律去设计特殊功能的纳米体系，为人类的发展做出更大贡献。

参考文献：

[1] 参考诺贝尔官方网站（http：//www.nobelprize.org）及媒体相关报道内容.

[2] Abbe E. Betragezur Theorie der Microscope und der MicroscopischenWahrnehmung. Archiv. Mikros. Anat. 1873， 9， 413.

[3] Rayleigh L. On the Electromagnetic Theory of Light. Phil. Mag. 1881， 11， 214.

[4] SpringK. R.， FellersT. J.， DavidsonM. W. ResolutionandContrastinConfocal Microscopy. http：//www.olympusfluoview.com/ theory/resolutionintro.html.

[5] Synge E. H. A Suggested Method for Extending Microscopic Resolution into the Ultra Microscopic Region. Phil. Mag. 1928， 6， 356～362.

[6] Binning G.， Rohrer H. Surface Studies by Scanning Tunneling Microscopy. Phys. Rev. Lett. 1982， 49， 57～61.

[7] Pohl D. W.， Denk W.， Lanz M. Optical Stethoscopy-Image Recording with Resolution λ/20. Appl. Phys. Lett. 1984， 44， 651.

[8] Harootunian A.， Betzig E.， Isaacson M.， Lewis A. SuperResolution Fluorescence Near-Field Scanning Optical Microscopy. Appl. Phys. Lett. 1986， 49， 674.

[9] Reddick R.C.， Warmack R.J.， Ferrell T.L. New Form of Scanning Optical Microscopy. Phys. Rev. B 1989， 39， 767.

[10] Betzig E.， Trautman J. K.， Harris T. D.， Weiner J. S.， Kostelak R. L. Breaking the Diffraction Barrier： Optical Microscopy on a Nanometric Scale. Science， 1991， 251， 1468～1470.

[11] Michael A. Paesler， Patrick J. Moyer， Near-Field Optics： Theory， Instrumentation， and applications， Wiley-Interscience， 1996.

[12][18][19]吕志坚，陆敬泽，吴雅琼，陈良怡.几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展[J].生物化学与生物物理进展，2009，（36）：1626～1634.

[13] BarakL. S.， Webb W. W. Fluorescent Low Density Lipoprotein for Observation of Dynamics of Individual Receptor Complexeson Cultured Human Fibroblasts. J. CellBiol. 1981， 90， 595～604.

[14] Betzig E.， Patterson G.H.， Sougrat R.， Lindwasser O.W.， Olenych S.， Bonifacino J. S.， Davidson M. W.， Lippincott-Schwartz J.， Hess H. F. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science， 2006， 313， 1642～1645.

[15] Rust M. J.， Bates M.， Zhuang X. W. Sub-Diffraction-Limit Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy （STORM）. Nat. Methods， 2006， 3， 793～795.

[16][20] Klar， T. A.； Jakobs S.； Dyba M.； Egner A.； Hell S. W.."Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000， 97， 8206～8210.

[17] Willig K.， Rizzoli S. O.， Westphal V.， Jahn R.， Hell S. W. STED-Microscopy Reveals That Synaptotagmin Remains Clustered after Synaptic Vesicle Exocytosis. Nature， 2006， 440， 935～939.