超分辨率荧光显微技术

葛春洋+马宏佳

摘要：介绍了2014年诺贝尔化学奖获奖成果超分辨率荧光显微技术的原理和发现过程、获奖者简况以及超分辨率荧光显微技术的应用前景。

关键词：诺贝尔化学奖；超分辨率荧光显微镜；受激发射损耗显微镜；光激活定位显微镜

文章编号：1008-0546（2014）11-0002-03 中图分类号：G633.8 文献标识码：B

doi：10.3969/j.issn.1008-0546.2014.11.001

北京时间2014年10月8日，瑞典皇家科学院宣布，将2014年诺贝尔化学奖授予美国科学家埃里克·贝齐格（Eric Betzig）、威廉姆·莫纳（William Esco Moerner）和德国科学家斯特凡·赫尔（Stefan W. Hell），以表彰他们为发展超分辨率荧光显微镜所做的贡献。

一、光学显微镜分辨率极限的存在

长期以来，光学显微镜的分辨率被认为不会超过光波波长的一半，这被称为“阿贝衍射极限”。1873年，德国科学家阿贝（E.Abbe）揭示了远场光学显微镜分辨率由于光的衍射效应和有限孔径分辨率极限而存在极限。这是由于可见光具有波动性，其可以发生衍射，因此光束不能无限聚焦。他的结论源于光学显微镜的分辨率的计算公式：

其中λ为光波波长，α为镜口角的一半，n为传播介质的折射系数。空气中n为1，α最大可为70度，此时，sinα约为0.94，根据波长最短的蓝光计算，λ≈450nm，则分辨率最小约为200nm。即阿贝分辨率极限的数值约为200nm。

1896年，英国物理学家瑞利（Rayleigh）提出，在成像光学系统中，分辨率是衡量分开相邻两个物点的像的能力。由于衍射，系统所成的像不再是理想的几何点像，而是一定大小的光斑（爱里斑），当两个物点过于靠近，其像斑重叠在一起，就可能分辨不出是两个物点的像，即光学系统中存在着一个分辨极限，这个分辨极限通常采用瑞利提出的判据：当一个爱里斑的中心与另一个爱里斑的第一级暗环重合时，刚好能分辨出是两个像，他归纳出一个常用分辨率公式：

Δmin=（λ为光波波长，α为镜口角的一半，n为传播介质的折射系数。）

这从另一个角度印证了“阿贝衍射极限”理论。因此，人们认为光学显微镜的成像效果受到光的波长限制，最大分辨率为光波的1/2。

二、光学显微镜分辨率极限的突破

科学发展的进程激发人们对更小物质的研究渴望，因此科学家们一直致力于超分辨率显微镜的研究。2014年诺贝尔化学奖的三位得主以创新手段“绕过”（突破）了这一极限，使光学显微镜的分辨率从微米级提高到纳米级，他们的发现使显微镜进入纳米显微镜时代。

（1）斯特凡·赫尔的贡献

2014年诺贝尔化学奖得奖的原理主要为两项，其一为斯特凡·赫尔研发的受激发射损耗显微技术（stimulated emission depletion，STED）。所谓的受激发射损耗（STED），指的是用一束激发光使荧光物质发光的同时，用另外的高能量脉冲激光器发射一束环型的波长较长的激光，将第一束光斑中大部分的荧光物质通过受激发射损耗过程淬灭至基态，并通过限制受激发射抑制的区域，获得小于衍射极限的发光点，从而显著地提高了显微镜的分辨率。2000年，赫尔使用STED显微镜首次得到了大肠杆菌的图像。

（2）埃里克·贝齐格和威廉姆·莫纳的贡献

第二项原理由埃里克·贝齐格和威廉姆·莫纳研究，即单分子显微镜的原理。该原理的核心为激活和淬灭单个荧光分子。他们通过每次分辨少数分散的分子，多次沉积这些图像得到一个纳米级的高密度的超级图像。

在莫纳之前，人们观测荧光分子时都是同时观测到几百万几千万个分子，得到的结果是其平均统计结果。而莫纳是第一个能够探测单个荧光分子的人，他于1989年观测到单个荧光分子。能够探测并观察单个荧光分子对于超分辨率显微镜极其重要。虽然单个荧光分子成像后也是一个0.2微米的光斑，但是在没有其他分子存在的情况下，它的中心位置可以更精确地被确定下来的。

1997年莫纳发现变异的绿色荧光蛋白可以随意打开和关闭，当他用波长488nm的光线去激发某种蛋白质时，它开始发出荧光，但一会荧光就消失了。此后不管他再使用任何光线去照射它，这个蛋白质都无法再发出荧光。但是，当他用波长为405nm的光线去照射它的时候，蛋白质又再次复活并发出荧光。莫纳将这些可以被激发的蛋白质融入溶胶，使其均匀分布在其中，这使得单个分子之间的距离就能大于阿贝衍射极限。由于这些分子被分散开来，一台常规的光学显微镜便可以区分来自单个分子发出的荧光——它们就像是带着开关的小灯泡。

贝齐格发明的光激活定位显微镜（photoactivated localization microscopy，PALM），其中所利用的就是莫纳发现的光激活方法。贝齐格利用微量的405nm激光照射细胞表面，使得其中极小部分荧光分子发出荧光。然后用488nm 激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子，确定这些分子的位置。再依次用405nm和488nm的激光照射，以激活另一小部分荧光分子。重复这个过程即可将样品中的所有分子定位出来，将这些分子的图像合成到一张图上，最后得到了比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的整个样品的图像。

值得一提的是，华裔科学家庄小威与贝齐格的工作在物理原理上完全一样。庄小威课题组独立发明的STORM技术使用激光“点亮”或“熄灭”细胞中的荧光，然后拍照。每次只“点亮”或“熄灭”细胞中一个位置。像逐行扫描一样，一点点记录细胞的图像，最后通过多幅图像叠合，得到完整、高分辨率图像。庄小威发表的论文显示，分辨率可以达到20纳米。两者的细微不同之处在于激发荧光材料的使用上，贝齐格用的是光敏蛋白，而庄小威用的是荧光染料。庄小威的相关论文于2006年8月9日发表在《自然·方法》期刊，而贝齐格的论文于次日（8月10日）发表在《科学》期刊，不过贝齐格的论文投出时间为2006年3月，比庄小威要早4个月。但贝齐格早在1995年就发表了理论设计论文。诺贝尔奖授予者解释说这是庄小威憾失诺贝尔奖的原因。但她在超分辨率显微镜领域做出的贡献仍不可否认。

三、获奖成果应用前景

科学家们的成果将显微技术带入“纳米”领域，让人类能够“实时”观察活细胞内的分子运动规律，为疾病研究和药物研发带来革命性变化。利用超高分辨率显微镜，可以让科学家们在分子水平上对活体细胞进行研究，如观察活细胞内生物大分子、细胞器微小结构以及细胞功能如何在分子水平表达及编码，对于理解生命过程和疾病发生机理具有重要意义。比如：在帕金森氏症、阿尔兹海默氏症（老年痴呆症）或亨廷顿氏症发作时，科学家们可以跟踪与之有关的蛋白质的变化；受精卵分裂并发育成胚胎的过程中，也可以观察这些单个蛋白质的变化。正如诺贝尔化学奖评审委员会所说，三位科学家的研究成果为微生物研究带来了几乎无限的可能，“理论上讲，如今没有什么物质结构小得无法研究。”

四、获奖者简介

斯特凡·赫尔

1962年生于罗马尼亚阿拉德。德国物理学家，马克斯·普朗克生物物理化学研究所所长。1990年获得海德堡大学物理学博士学位。1997年，在马克斯·普朗克学会在哥廷根的生物物理化学研究所任研究员。2003年至今，赫尔是位于海德堡的德国癌症研究中心高分辨率光学显微技术部门的主任。

威廉姆·莫纳

1953年生于美国加利福尼亚州的普莱森顿。化学家，单分子光谱和荧光光谱领域的著名专家。毕业于圣路易斯华盛顿大学。1982年，获得康奈尔大学物理学博士学位。1998年至今，在斯坦福大学担任教授。

埃里克·贝齐格

1960年生于美国密歇根州安娜堡。美国神经科学家、发明家、应用物理学家。霍华德·休斯医学研究所的研究带头人。他毕业于加州理工学院的物理学系，1988年获得美国康奈尔大学博士学位。后在贝尔实验室工作。

参考文献

[1] M？覽ns Ehrenberg .Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry 2014. The Royal Swedish Academy of Sciences，2014，10

[2] M？覽ns Ehrenberg，Sven Lidin. The Nobel Prize in Chemistry 2014.The Royal Swedish Academy of Sciences，2014，10

[3] 毛峥乐，王琛，程亚等. 超分辨远场生物荧光成像——突破光学衍射极限[J]. 中国激光，2008，35（9）：1283-1307

[4] 吕志坚，陆敬泽，吴雅琼等. 几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展[J]. 生物化学与生物物理进展，2009，36（12）：1626-1634

[5] 杨鹏，艾华. 受激发射损耗显微术及扩展技术[J]. 激光与光电子学进展，2011，（5）：32-40

[6] http：//www.guokr.com/article/439295/

[7] http：//tieba.baidu.com/p/3339514957/

[8] http：//money.163.com/14/1009/04/A83D1HLM00253B0

H.html

三、获奖成果应用前景

科学家们的成果将显微技术带入“纳米”领域，让人类能够“实时”观察活细胞内的分子运动规律，为疾病研究和药物研发带来革命性变化。利用超高分辨率显微镜，可以让科学家们在分子水平上对活体细胞进行研究，如观察活细胞内生物大分子、细胞器微小结构以及细胞功能如何在分子水平表达及编码，对于理解生命过程和疾病发生机理具有重要意义。比如：在帕金森氏症、阿尔兹海默氏症（老年痴呆症）或亨廷顿氏症发作时，科学家们可以跟踪与之有关的蛋白质的变化；受精卵分裂并发育成胚胎的过程中，也可以观察这些单个蛋白质的变化。正如诺贝尔化学奖评审委员会所说，三位科学家的研究成果为微生物研究带来了几乎无限的可能，“理论上讲，如今没有什么物质结构小得无法研究。”

四、获奖者简介

斯特凡·赫尔

1962年生于罗马尼亚阿拉德。德国物理学家，马克斯·普朗克生物物理化学研究所所长。1990年获得海德堡大学物理学博士学位。1997年，在马克斯·普朗克学会在哥廷根的生物物理化学研究所任研究员。2003年至今，赫尔是位于海德堡的德国癌症研究中心高分辨率光学显微技术部门的主任。

威廉姆·莫纳

1953年生于美国加利福尼亚州的普莱森顿。化学家，单分子光谱和荧光光谱领域的著名专家。毕业于圣路易斯华盛顿大学。1982年，获得康奈尔大学物理学博士学位。1998年至今，在斯坦福大学担任教授。

埃里克·贝齐格

1960年生于美国密歇根州安娜堡。美国神经科学家、发明家、应用物理学家。霍华德·休斯医学研究所的研究带头人。他毕业于加州理工学院的物理学系，1988年获得美国康奈尔大学博士学位。后在贝尔实验室工作。

参考文献

[1] M？覽ns Ehrenberg .Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry 2014. The Royal Swedish Academy of Sciences，2014，10

[2] M？覽ns Ehrenberg，Sven Lidin. The Nobel Prize in Chemistry 2014.The Royal Swedish Academy of Sciences，2014，10

[3] 毛峥乐，王琛，程亚等. 超分辨远场生物荧光成像——突破光学衍射极限[J]. 中国激光，2008，35（9）：1283-1307

[4] 吕志坚，陆敬泽，吴雅琼等. 几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展[J]. 生物化学与生物物理进展，2009，36（12）：1626-1634

[5] 杨鹏，艾华. 受激发射损耗显微术及扩展技术[J]. 激光与光电子学进展，2011，（5）：32-40

[6] http：//www.guokr.com/article/439295/

[7] http：//tieba.baidu.com/p/3339514957/

[8] http：//money.163.com/14/1009/04/A83D1HLM00253B0

H.html

三、获奖成果应用前景

科学家们的成果将显微技术带入“纳米”领域，让人类能够“实时”观察活细胞内的分子运动规律，为疾病研究和药物研发带来革命性变化。利用超高分辨率显微镜，可以让科学家们在分子水平上对活体细胞进行研究，如观察活细胞内生物大分子、细胞器微小结构以及细胞功能如何在分子水平表达及编码，对于理解生命过程和疾病发生机理具有重要意义。比如：在帕金森氏症、阿尔兹海默氏症（老年痴呆症）或亨廷顿氏症发作时，科学家们可以跟踪与之有关的蛋白质的变化；受精卵分裂并发育成胚胎的过程中，也可以观察这些单个蛋白质的变化。正如诺贝尔化学奖评审委员会所说，三位科学家的研究成果为微生物研究带来了几乎无限的可能，“理论上讲，如今没有什么物质结构小得无法研究。”

四、获奖者简介

斯特凡·赫尔

1962年生于罗马尼亚阿拉德。德国物理学家，马克斯·普朗克生物物理化学研究所所长。1990年获得海德堡大学物理学博士学位。1997年，在马克斯·普朗克学会在哥廷根的生物物理化学研究所任研究员。2003年至今，赫尔是位于海德堡的德国癌症研究中心高分辨率光学显微技术部门的主任。

威廉姆·莫纳

1953年生于美国加利福尼亚州的普莱森顿。化学家，单分子光谱和荧光光谱领域的著名专家。毕业于圣路易斯华盛顿大学。1982年，获得康奈尔大学物理学博士学位。1998年至今，在斯坦福大学担任教授。

埃里克·贝齐格

1960年生于美国密歇根州安娜堡。美国神经科学家、发明家、应用物理学家。霍华德·休斯医学研究所的研究带头人。他毕业于加州理工学院的物理学系，1988年获得美国康奈尔大学博士学位。后在贝尔实验室工作。

参考文献

[1] M？覽ns Ehrenberg .Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry 2014. The Royal Swedish Academy of Sciences，2014，10

[2] M？覽ns Ehrenberg，Sven Lidin. The Nobel Prize in Chemistry 2014.The Royal Swedish Academy of Sciences，2014，10

[3] 毛峥乐，王琛，程亚等. 超分辨远场生物荧光成像——突破光学衍射极限[J]. 中国激光，2008，35（9）：1283-1307

[4] 吕志坚，陆敬泽，吴雅琼等. 几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展[J]. 生物化学与生物物理进展，2009，36（12）：1626-1634

[5] 杨鹏，艾华. 受激发射损耗显微术及扩展技术[J]. 激光与光电子学进展，2011，（5）：32-40

[6] http：//www.guokr.com/article/439295/

[7] http：//tieba.baidu.com/p/3339514957/

[8] http：//money.163.com/14/1009/04/A83D1HLM00253B0

H.html