虫草素在Aβ1-42寡聚体诱导AD模型大鼠神经元损伤中的作用①

郑衍芳，吕文昌，孙田静，郑丽萍，张文权，宋志语，周 袁

(遵义医学院珠海校区生理学教研室，广东 珠海 519041)



虫草素在Aβ1-42寡聚体诱导AD模型大鼠神经元损伤中的作用①

郑衍芳，吕文昌，孙田静，郑丽萍，张文权，宋志语，周 袁

(遵义医学院珠海校区生理学教研室，广东 珠海 519041)

虫草素为天然中药材冬虫夏草和人工培养蛹虫草的有效成分。近年来研究表明，虫草素具有抗肿瘤，抗衰老，抗白血等药理作用。阿尔茨海默病是一种神经系统退行性疾病。可溶性Aβ1-42寡聚体具有神经细胞毒性且是阿尔茨海默病发病的关键因素。本文我们探讨了虫草素在Aβ1-42 寡聚体诱导 AD 模型大鼠神经元损伤中的作用。

虫草素;Aβ1-42 寡聚体;AD 模型;神经元

随着研究的深入，虫草素的药理作用越来越被人们所重视，被广泛应用于生活保健和临床治疗。其独特的抗衰老作用也为一些神经系统退行性疾病的治疗开辟了新的途径。比如：阿尔茨海默病(AD)，是世界上难以治愈的疾病之一，主要表现为学习记忆的障碍。所以理想AD模型的准确建立为进一步探索和明确AD的发病机理奠定基础。其中，Aβ1-42寡聚体是多种AD致病因子中比较理想的诱导物，其强大的神经毒性作用和较接近该病的发病特点等优点能更加准确的建立合适的AD模型。因此，用虫草素作用于以Aβ1-42寡聚体诱导的AD模型上是有一定理论支持并具有可行性的。这不仅丰富了建模内容和手段，也为进一步探索AD的发病机理和治疗提供了可靠依据。

1 虫草素

虫草素(3′-脱氧腺苷)是蛹虫草的活性成分之一，分子式为C10H13N5O3，分子质量约为249D ，其性质呈碱性，针状或片状结晶， 熔点达230～23l℃， 最大吸收波长为259nm[1]。是第一个从真菌中提取的核苷类抗生素。

1.1 虫草素的富集与检测

目前虫草素的获得方式有化学合成和从菌种中提取和纯化两种方式。近年来，从蛹虫草中提取获得虫草素的研究成果颇多。如：叶晶晶等[2]采用单次单因子法和(BP)设计等方法配制出最佳液体培养基配方进行液体发酵，提高了得菌量。培养蛹虫草时用马铃薯综合培养基和玉米培养基来培养效果较好。虫草素的产率也受光照和光照时数，不同碳源，营养及突变因素等的多种影响，很多物理方法也能提高其产率。如：经过同场强处理的磁化水能够显著提高蛹虫草液体培养的胞外酶活性，主要药用成分的含量[3]。提取蛹虫草的常见方法有回流提取法，超声提取法，索氏提取法等。虫草素的分离方法主要是离子交换树脂法和硅胶柱层析法。检测技术主要包括HPLC(高效液相色谱法)、LC-MS(液相色谱-质谱联用)、分光光度法、CE(毛细管电泳)和TLC(薄层色谱)等且各有其特点。如：用反相HPLC.UVD(紫外光检测)测定蛹虫草中虫草素的方法，此方法灵敏度高且受样品基质影响小[4]。

1.2 虫草素的药理作用

虫草素作为蛹虫草产生的活性成分之一，具有抗肿瘤，抗衰老，改善记忆力，抗白血病，抗菌，免疫调节，降血糖，清除体内自由基等重要作用。但是由于虫草素在体内的脱氨基作用，进一步限制了临床应用。首先，表现在抗肿瘤方面。虫草素能够抑制口内鳞状瘤细胞的增殖，通过刺激气腺苷受体表现抗瘤活性[5]。其次，抑菌与消炎方面，虫草素对葡萄球菌、链球菌、炭疽杆菌、猪出血型败血症杆菌等均有抑制作用。降血糖方面，张松[6]等通过研究虫草素能使糖尿病小鼠的空腹血糖值下降,OGTT中的血糖AUC下降。抗衰老方面，虫草素能提高肝中SOD(超氧化物歧化酶)和脑中一元胺氧化酶的活性，故其具有抗衰老作用。在改善记忆方面，党和勤[7]等首先用虫草素作用以东莨菪碱诱导德记忆获得障碍型小鼠和正常鼠，通过经典的跳水法观察两者错误反应的次数，结果虫草素作用的记忆获得障碍型小鼠反应错误次数少。表明虫草素对记忆力有改善作用[8]。此外虫草素通过抑制Ucox-2的基因表达来实现抗血管平滑肌等的作用，也有实验表明，虫草素抗白血病与其抑制白血病细胞中末端脱氧核苷酸转移酶的活性有关。

2 Aβ1-42 寡聚体

2.1 选择Aβ1-42 寡聚体诱导AD模型的依据

2.1.1 单体寡聚体及纤维状Aβ1-42毒性作用比较：可溶性的Aβ包括单体、寡聚体、纤维状等形式，且不同形式的Aβ的毒性不同，对AD的发病机制也不同。王建秀等[9]用原子力显微镜(AFM)观察比较Aβ1-42各种可溶形式发现：①Aβ寡聚体是Aβ存在的一种主要状态。②Aβ1-42寡聚体在低浓度即可杀伤细胞，损伤作用呈现浓度-时间依赖方式，且毒性最大。③Aβ寡聚体经过各种组装形成纤维状的Aβ后，毒性反而下降。

2.1.2 Aβ1-42Aβ1-40 与Aβ25-35 在阿尔茨海默病模型复制中的优势比较：Aβ1-42、Aβ1-40 与Aβ25-35 均来源于APP，但三种淀粉蛋白在AD模型的建立中存在一定的差异。老年斑的形成是AD建模成功的关键，从淀粉样斑块的沉积方面，Aβ1-42的疏水性强，比Aβ1-40更易聚集形成淀粉样斑块。效果较为优于Aβ1-40， 因此认为Aβ1-42能更好的模拟AD的发展过程[10]。 在相同条件下Aβ1-42与Aβ25-35的聚集状态不同，Aβ25-35的纤维结构比Aβ1-42短，且未能形成典型的螺旋结构，这些均是影响Aβ25-35 纤维聚集的因素。因此Aβ25-35 显然没有Aβ1-42 更能促进SP形成。因此我们可以认为Aβ1-42更适用于AD模型的成功建立。

2.2 Aβ1-42寡聚体的毒性作用机制

Aβ寡聚体的几种毒性作用机制：①对细胞内Ca2+的影响：细胞膜上的K通道被Aβ1-42寡聚体破坏后，导致大量的Ca2+内流，细胞内Ca2+浓度的持续升高，紊乱的Ca2+会对神经细胞的结构和功能产生一定影响。②氧化应激：Aβ不仅自身可以产生自由基，还可以通过其他方式诱导产生大量自由基，形成活性氧，从而对神经元产生氧化应激损伤[11，12]。③胞内Aβ寡聚体：细胞内Aβ的聚集也是AD的一个重要病理特征。④Aβ1-42寡聚体可通过下调Bcl-2蛋白表达，激活caspase-3发挥神经毒性，诱导细胞凋亡。⑤与细胞表面受体之间的相互作用：Aβ1-42寡聚体可以与兴奋性的天冬氨酸受体2结合，使其活化，最终致使活性氧的产生、神经细胞死亡以及线粒体的功能遭到破坏[13]。AD发病的最初阶段,Aβ1-42就开始在神经元内部聚集，而到后期Aβ1-42则聚集于多泡体,这是由于神经突触形态的发生了改变。因此, 认为Aβ极有可能是在细胞内部发挥其毒性。

2.3 Aβ与AD的关系

AD患者的主要病理学标志是神经细胞外存在老年斑，其主要成分是Aβ。Aβ是β-和γ-分泌酶的蛋白水解而来，含39～43个氨基酸，正常人大脑神经细胞可产生Aβ，且Aβ的产生与降解是保持相对平衡的，而AD患者大脑内的Aβ出现异常沉积[14]。Lambert[15]等研究发现了Aβ毒性最大的形式—可扩散配体(ADDLs)，这种神经毒性物质在纳摩尔浓度即可损伤神经元、诱导氧化应激反应和影响突触的可塑性等作用。越来越多的研究证明Aβ是引起AD早期记忆障碍的主要原因，因此Aβ成为了近年来AD研究的热点。

3 常见AD动物模型的建立

3.1 SAMP8衰老型AD动物模型

据现今的临床数据表明，阿尔茨海默病的发病人群为老年人，因此衰老与AD有着密不可分的联系，都会出现神经元纤维的缠结和淀粉样斑块。就衰老而言，可分为自然衰老和快速衰老，但自然衰老诱导的AD动物模型脑组织内的神经元纤维的缠结和淀粉样斑块较少，这说明正常的衰老并不能完全模拟AD的发病[16]。随着AD动物模型的进一步研究，快速老化小鼠亚系8(SAMP8)诱导的AD逐渐被大多数研究者所认可，Gasadesus 等在研究SAMP8的模型实验中发现，随着动物年龄的增长，动物脑内会出现大量沉积的Aβ[17]。Aβ是淀粉样斑块的主要成分，会导致动物的学习和记忆功能遭到严重的损害。现今SAMP8在大鼠诱导的AD动物模型中得到广泛的应用，主要是它不仅具有自然衰老的特征，而且还表现出与AD极为相似的病理特征。SAMP8是从AKR/J筛选出来的，主要的特征是寿命短，能快速衰老并且在年龄增长的过程中伴有学习记忆等功能障碍[18]。因此，与自然衰老诱导的AD动物模型相比，SAMP8是目前较为理想的能替代AD的动物模型[19]。

3.2 Aβ灌注诱导AD动物模型

研究表明脑组织中老年斑(SP)的形成是导致AD的主要病理原因，而Aβ是SP的核心成分。越来越多的实验证明Aβ在AD的发病过程中发挥着重要的作用，因此“β-淀粉样蛋白假说”也被科学界所认同。大量研究证实，大脑海马区与学习和记忆等功能有关，若在大脑两侧的海马区弥漫性的注射Aβ，将会导致Aβ的大量聚集并且会出现与AD相似的病理特征。所以弥漫性的注射Aβ是诱导AD的一种较好的动物模型。在国内为的研究中，研究者通常采用Aβ1-40和Aβ25-35进行急性注射来诱导AD，该模型虽然有Aβ的沉积，但其持续时间并不长[20]。近年的研究表明，Aβ可分为Aβ1-40、Aβ25-35和Aβ1-42三种片段，根据Aβ的神经毒性，Aβ1-42的毒性是三者中最强的，所以近年来用Aβ1-42灌注诱导AD动物模型得到了广泛的认可。

3.3 胆碱能神经系统损害有关的AD动物模型

人大脑的中枢神经胆碱能系统的活性与人的认知功能和学习记忆过程有着密切关系。基底前脑胆碱能神经元、皮层和海马以及其之间的通路是人学习记忆的重要基础结构，乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)是参与学习记忆的一种重要中枢神经递质[21]。因此可以通过研究各种破坏胆碱能神经系功能的方法，制作一种模拟AD的动物模型。物理性的胆碱能损伤，可通过切断海马穹窿伞通路阻断基底前脑胆碱能投射纤维[22]，造成胆碱功能障碍，使大鼠的学习记忆能力下降，但此方法造成的损伤面积大，又不能产生老年斑、 A β代谢产物沉积等典型AD病理特征，因而采用率不高。化学性的胆碱能损伤是给大鼠腹腔注射胆碱能拮抗剂(东莨若碱)，与大脑皮质中的胆碱能结合位点竞争性结合，造成胆碱能系统功能障碍，使实验动物出现如学习记忆力下降、认知障碍等行为学变化[23]。此种方法也不能产生AD的病理变化，但是这种造模方法比较简便，且所需的费用较低，是制备AD动物模型较为适用的方法之一。

4 神经元细胞体外培养

4.1 海马区神经元分离培养

取3月龄Wistar大鼠,在无菌条件下，先用乙醚对大鼠进行麻醉，立即用颈椎脱臼法处死后，快速剥离大鼠脑组织，置于RPMI - 1640培养基中进行洗涤。剪碎脑组织并加入0.25%胰蛋白酶，在37℃的条件下用磁力搅拌器对分离出的脑组织进行消化一段时间，等待后取适量搅拌后的上层液体加入一定体积于装有一定量的Hanks液离心管中，将整支离心管配平后，在1200rpm条件下离心10min，收集离心管内的沉淀。再用上述同样的方法再次洗涤沉淀一次。完成操作后，向其中加入混有一定量小牛血清的RPMI - 1640培养基，立即吹打沉淀，结束吹打开始对收集到的神经元进行计数。计数后于37℃, 5%CO2恒温培养箱培养24h后更换含Neurol Medium和B27的培养液[24]，将培养液平均分成实验组(1、2、3)与对照组，接种细胞于预先涂布有L-多聚赖氨酸的24孔细胞培养板上，以后每培养72h后更换一次1/2的培养液。在更换培养液的同时向实验组1中加入10mg/L的虫草素溶液，用同样的方法向实验组2中加入20mg/L的虫草素溶液，向实验组3中加入30mg/L的虫草素溶液。培养10～14d[25]后用酶标仪进行MTT检测，用倒置相差显微镜观察各组神经元胞体面积、周长、最长突起长度，用激光扫描共聚焦显微镜观察各组神经元凋亡情况。

4.2 海马神经元的鉴定

胰蛋白酶消化以后的神经细胞，经过吹散后，直接移入带有经杀菌后的盖玻片的6孔板中，放置在5%CO2，温度为37℃的培养箱中培养；培养48h以后取出盖玻片置于平皿中，并加入一定量由甲醇：冰醋酸=3：1配置而成的固定液，总共固定25min；完成固定操作后用PBS冲洗盖玻片3次，每次冲洗3min，在盖玻片上慢慢滴加体积为50μL的过氧化酶阻断剂，置于室温下孵育10min；按照上述的方法继续进行洗涤，以同样的方法继续滴加50μL的羊血清，同样置于室温下孵育10min后冲洗。缓慢滴加具有一定稀释度的50μL GFAP、CD68以及NF抗体，置于室温下孵育10min以后马上冲洗，冲洗后缓慢滴加50μL生物素标记，用该标记羊抗大鼠的抗体，置于室温下孵育10min以后继续经行洗涤，完成后向玻片上加入链霉菌抗生物素 - 过氧化酶溶液50μL，置于室温下孵育10min，进行最后一次洗涤，向其中滴加新配置完成的 DAB显色溶液，100μL，封片，镜下观察[26]。

据临床资料显示，临床上的痴呆有很多种类型，但50%以上属于阿尔茨海默病(AD)。我国约有AD患者500万，占全世界病例的1/4。AD病程长,可为5～20年，其病情的长期性和进行性加重，给患者及其家庭带来沉重的经济和心理负担。本文我们就虫草素在Aβ1-42寡聚体诱导AD模型大鼠神经元损伤中的作用进行了初步的探讨，为阿尔茨海默病的治疗提供了新的方法，并为虫草素的药用价值开辟了新的前景。

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The effects of Cordycepin on rat’s neuron injury of AD model induced by Aβ1-42 oligomer

ZHENGYan-fang,LÜWen-chang,SUNTian-jing,ZHENGLi-ping,ZHANGWen-quan,SONGZhi-yu,ZHOUYuan

(Physiology Department in Zunyi Medical School, Zhuhai 519041, Guangdong, China)

Cordycepin is an effective component for natural Chinese herbal medicine Cordyceps sinensis and artificial cultivation of Cordyceps militaris. Recent studies showed that cordycepin has anti-tumor, anti-aging, anti white blood pharmacological effects. Alzheimer's disease is a degenerative disease of nervous system. Soluble A beta 1-42 oligomers has nerve cell toxicity, and is a key factor in the pathogenesis of Alzheimer's disease. In this paper, we investigate the effects of Cordycepin on rat’s neuron injury of AD model induced by Aβ1-42 oligomer.

cordycepin; A beta 1-42 oligomers; AD model; neurons

国家自然科学基金资助项目，编号：31040075。

郑衍芳(1981～)女，山东济宁人，硕士，讲师。

2.41

A

1008-0104(2015)03-0008-03

2014-09-20)