携载紫杉醇的纳米粒子靶向治疗脑胶质瘤的研究进展①

李明军,荣向辉,李英夫,吕霁

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)



携载紫杉醇的纳米粒子靶向治疗脑胶质瘤的研究进展①

李明军,荣向辉,李英夫,吕霁

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

神经胶质瘤；紫杉醇；血脑屏障；多功能纳米粒子；靶向

肿瘤是严重威胁人类生命健康的重大疾病之一，我国肿瘤最新发病率已达千分之二，死亡率为千分之一点五。脑神经胶质瘤是发病率最高的脑肿瘤,也是死亡率最高的十大肿瘤之一，以及脑胶质瘤瘤体细胞呈浸润性生长的特点,使得目前治疗脑胶质瘤的主要手段是手术切除配合放、化疗,但是均很难以达到良好的治疗目的[1，2]，这是脑神经胶质肿瘤治疗的最大障碍。而且神经胶质瘤肿瘤组织的微环境与正常组织存在显著的差别，血脑屏障(BBB)的存在不利于药物通过血管输送到肿瘤组织的深部及细胞内药物作用的靶位。恶性脑胶质瘤患者术后中位生存期很短，尚不足两年。因此如何选择合适的抗肿瘤药物，可通过BBB、靶向肿瘤微环境、提高药物对肿瘤组织的选择性和渗透性并能跨膜输送至细胞内达到有效浓度已经成为脑肿瘤治疗的新挑战。

紫杉醇(Paclitaxel, 简称PTX)是从短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)中提取的双萜类天然产物又经化学修饰合成, 为一类新型抗肿瘤药物[3]，其作用机理以稳定微管并防止微管解聚及调节信号传导，从而使肿瘤细胞无法有效分裂而死亡。然而, 由于紫杉醇资源匮乏,水溶性低,难以通过血脑屏障等, 使其在临床上在脑部肿瘤，特别是神经胶质瘤的应用治疗受到很大程度的限制[4]。因此，研发新型紫杉醇载药体系和剂型及研究其抗肿瘤活性，靶向作用于脑部肿瘤，对于临床治疗脑神经胶质瘤用药具有非常重要的意义[5]。

1 国内外研究现状分析

由于血脑屏障的存在，使紫杉醇等抗肿瘤药物不能在脑内富集发挥药效，限制了紫杉醇在脑部肿瘤治疗中的应用，而且肿瘤组织的微环境与正常组织存在显著的差别，不利于药物通过血管输送到肿瘤组织的深部及细胞内药物作用的靶位。应用纳米载药系统解决抗肿瘤药物透过血脑屏障、实现药物在脑内的富集脑靶向问题吸引了广大科研人员注意力。利用纳米微粒作为小分子抗肿瘤药物靶向传递系统的研究正在快速的发展和进行中。这种纳米载药系统不仅能够改善疗效、提高抗肿瘤药物的生物利用率、减少临床用药量、减轻或消除毒副作用，还具有药物释放的可控性和肿瘤靶向定位的优点。因此，肿瘤的靶向治疗应运而生并且迅速成为研究的热点。

1.1 多功能串联肽装饰的紫杉醇脂质体

由于血-脑屏障(BBB)的原因，神经胶质瘤的药物治疗存在极大的挑战。为了使药物能特异性地积聚在脑胶质瘤病灶和进入大脑后渗透到肿瘤核心，降低对正常脑组织毒性，实现有效的治疗。LiuY等人在这项研究中，将一个特定的环状配位体RGD肽缀合至于细胞穿透肽R8上开发一种多功能肽R8-RGD。与单独R8和RGDR相比较，分别与显示的三维胶质瘤球体和血脑屏障模型体外实验有效穿透性，8-RGD拥有通过2～30倍的增加脂质体的细胞摄取量。C6胶质瘤荷瘤小鼠体内研究表明，R8-RGD-脂全身给药后可以有效地输送到大脑和选择性累积在胶质瘤灶。当在脂质体载紫杉醇(PTX)，R8-RGD-脂可对C6细胞细胞凋亡引起强烈的抑制，在颅内胶质瘤荷瘤小鼠获得的最长存活时间。最后，所有的结果表明，在串联肽R8-RGD是一个有希望的具有多功能配位体，包括血脑屏障输送，神经胶质瘤靶向和肿瘤穿透性。R8-RGD-脂被证明是一个潜在的抗神经胶质瘤的药物递送系统[6]。

1.2 装饰EGFP-EGF1(ENP)纳米颗粒靶向脑胶质瘤的新生血管和胶质瘤治疗

新生血管和神经胶质瘤细胞具密切相关性，可能是相互促进神经胶质瘤生长，针对这两个方向我们研究，与那些针对其中的一个方向的相比较，我们发现针对新生血管和神经胶质瘤细胞双靶向策略是更有前途的。在我们报道的药物递送系统，其中纳米颗粒被饰以EGFP-EGF1(ENP)，来自于在神经胶质瘤组织中VII因子与组织因子(TF)融合蛋白的的特殊亲合力的过表达的研究。通过针对新生血管和神经胶质瘤细胞这两个方面的研究，体外蛋白质结合测定法表明：EGFP-EGF1作用至C6细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形成的人工血管模型EGFP-EGF1-TF的相互作用显著增强纳米颗粒摄取、HUVEC和神经胶质瘤C6细胞以及C6胶质瘤球状纳米颗粒的渗透，并由此，它们有效通过两个单层细胞层和提高了对神经胶质瘤细胞毒性作用。在神经胶质瘤的小鼠的体内成像证实ENP在胶质瘤组织中特异性蓄积。纳米颗粒体内分布直观地表明ENP主要作用于两个血管外的神经胶质瘤细胞和新生血管细胞。药效学结果表明，与其他组进行比较，加载ENP的PTX(ENP-PTX)显著延长神经胶质瘤小鼠的平均存活时间。与其他治疗方法相比，TUNEL法和HE染色显示ENP-PTX治疗引起的显著肿瘤细胞凋亡，肿瘤坏死。总之，结果证明EGFP-EGF1功能化纳米粒子对脑胶质瘤双靶向的治疗具有巨大发展潜力[7]。

1.3uPA激活细胞穿透肽(ACPP)的多靶向性药物传递系统

经过研究，现在大家都明白肿瘤的生长是多途径的综合结果，神经胶质瘤实质细胞和间质细胞是密切相关的，相互代偿的。因此，针对他们两者的给药策略，可能获得更多有前途的治疗效果。ZhangB,等在研究中，开发了用于治疗脑胶质瘤(ANP)的改性的uPA激活细胞穿透肽(ACPP)的多靶向性药物传递系统。体外实验证明，与传统相比饰有细胞穿透肽(CPP)或ACPP纳米粒子能显著提高C6胶质瘤细胞的吸收球状纳米颗粒(NP和纳米粒子渗透到神经胶质瘤)的能力，在活体动物实验表明，ANP脑胶质瘤的细胞内积累比NP装饰带或不带CPP了更具体。ACPP促成胶质瘤细胞内纳米颗粒积累，ANP不仅能够定位于胶质瘤薄壁细胞，也可与基质细胞，包括新血管细胞和肿瘤相关巨噬细胞。证明ACPP药效学结果由纳米颗粒显著延长荷瘤小鼠的存活时间，可显著改治疗效果。结果表明，纳米改性的uPA敏感ACPP可达到多种类型的细胞组织，并提供一种新的胶质瘤靶向治疗策略[8]。

1.4 装载紫杉醇脑靶向的转铁蛋白结合的聚磷酸酯混合胶束

由于药物穿过血-脑屏障(BBB)的低效价，药物输送受到阻碍，药物治疗中枢神经系统(CNS)肿瘤疾病的治疗受到限制。转铁蛋白(TF)可以促进纳米载体通过铁蛋白受体(TFR)介导的途径转运作用。在这项研究中，TF-改性装载紫杉醇聚磷酸酯混合胶粒(TPM)，制备并评价聚磷酸酯的混合胶束形成的核-壳结构其在体外和体内脑靶向的效率。在水溶液中，其表现出高的药物截留效率(89.9 ±3.4)%此外，胶束显示的溶血在2.0mg/mL可忽略不计。该TPM是(87.85±2.32)nm的电势-12.33±1.46mV和听PTX听呈持续释放TPM，TPM证实细胞摄取和脑积累增强。2和1.8倍PMT，PM表现最强的抗胶质瘤活性，意味着小鼠颅内U-87MG听神经胶质瘤与TPM(39.5d)治疗的生存期显著长于单纯紫杉醇(33.6d)处理。这些结果表明，与铁蛋白缀合的胶束可以是一个有希望用于脑靶向药物递送的载体[9]。

1.5 载有阿霉素和紫杉醇的转铁蛋白结合的磁性二氧化硅纳米粒子的PLGA

有效治疗恶性脑胶质瘤的药物由穿过血 - 脑屏障(BBB)并穿过血液 - 肿瘤屏障(BTB)的低渗透差输送而受到阻碍。在这项研究中，转铁蛋白缀合的磁性二氧化硅的PLGA纳米颗粒(MNP-MSN-PLGA-铁蛋白纳米粒)配制来克服这些障碍。这些纳米颗粒装载有阿霉素(DOX)和紫杉醇(PTX)，在体外和体内进行它们的抗增殖作用评价。在体外细胞毒性的实验中，载药纳米颗粒作用U- 87细胞进行评价。通过磁场的存在和TF的使用，载药纳米颗粒随细胞的摄取可以分别增强靶向配体，特别是，含DOX的PTX-NPS-Tf中，含DOX的PTX纳米粒，含DOX的PTX-NPS-TF和自由铁蛋白的治疗。含DOX的PTX-NPS-TF和相比磁场处理的细胞表现出最高的细胞毒性;载药纳米颗粒的体内治疗效果进行了评价，在BALB/c裸鼠的颅内种植U-87MG-luc2进行造模，实施动物实验。相比含DOX的PTX-NPS-铁蛋白治疗表现最强的抗神经胶质瘤活性，PTX-NPS-Tf中，含DOX的NPS-铁蛋白空白MNP-MSN-PLGA-铁蛋白纳米粒应用后并没有表现出急性毒性。总体而言，MNP-MSN-PLGA-铁蛋白纳米粒是有希望应用于实践，双重药物有效治疗脑胶质瘤的合适载体[10]。

1.6 聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)-CO-PEG嵌段共聚物纳米颗粒

紫杉醇纳米粒子穿透血脑屏障可改善恶性胶质瘤治疗。在大多数癌症，包括原发性脑肿瘤，由于肿瘤内药物分布差和药物短的半衰期强烈限制化疗药疗效。对于不能完全手术切除的神经胶质瘤，通过控制聚合物局部的释放或靶向药物递送是一种很有前途的方法来治疗浸润脑肿瘤。然而，药物渗透与传统疗法局部有限的，因为小分子药物往往进入他们遇到的最近的组织细胞，且其渗透作用只持续很短的距离。纳米颗粒可以避免与肿瘤细胞外基质粘附相互作用可以提高药物分布和当作用到肿瘤区域维持广泛的药物释放。我们以前曾研究表明当涂覆有异常致密层的聚(乙二醇)(PEG)，当纳米颗粒直径达114纳米时，聚苯乙烯纳米颗粒模型能够在正常的脑组织中迅速扩散，可以减少粘合剂的相互作用。这里，NanceE等人研究表明，携载紫杉醇(PTX)平均直径为70nm的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)-CO-PEG嵌段共聚物纳米颗粒比类似尺寸的携载PTXPLGA颗粒(不含PEG)或未包封的PTX相比能够有100倍的扩散速度，PEG化的加载PTX纳米粒局部应用到既定脑胶质瘤时能显著延迟肿瘤生长。结合载药PLGA-PEG纳米粒子增强分布于肿瘤浸润面，延缓肿瘤生长，证明了脑肿瘤实质内纳米粒子穿透力提高了，同时提高治疗效果。使用载药脑穿透纳米颗粒是一种很有前途的方法来实现持续的和更均匀的药物输送到治疗侵袭性胶质瘤和潜在的其他脑部疾病。

现在用于纳米药物载体的材料主要是壳聚糖(CS)和磷脂(PE)的聚合物。壳聚糖具有生物降解性、生物相容性、生物粘附性和促渗透作用，对人体几乎无毒副作用，已被广泛应用于医学领域。此外，由于壳聚糖分子上具有活性氨基和羟基，为接枝反应和离子相互作用提供了基础，因此适合作为药物控释系统的载体材料 。磷脂酰乙醇胺在动物中是通过胞苷二磷酸乙醇胺和1，2-甘油二酯的反应生成的，经磷酯酶A的作用生成溶血磷脂酰乙醇胺。聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺纳米胶束粒径小、尺寸均一，作为药物载体近年来也受到关注, 但其昂贵的价格使它的实际应用受到限制。开发一种价格便宜、制备方法简单的载体，为临床应用提供新的载体材料成为研究的重点。

纳米药物载体还可以根据肿瘤细胞表面的受体连接相应的化合物，使其具有对肿瘤的主动靶向作用。研究证实在纳米粒子表面连接乳铁蛋白(Lf)、转铁蛋白(Tf)和Angiopep肽、uPA激活细胞穿透肽(ACPP)等均能提高纳米粒通过血脑屏障的能力，有较显著的脑肿瘤靶向作用。此外，纳米载药系统还能够进行荧光标记。贵金属纳米团簇是新近发现的适合纳米粒子的荧光标记物，是由Au、Ag或Pt等贵金属的几个至几十个原子组成的具有荧光水溶性的分子级聚集体，其特有的量子尺寸效应使其荧光发射光谱在可见光到近红外光区范围内可调谐。此外，贵金属纳米团簇具有生物相容性好、光稳定性强且在所有相关时间尺度上无闪烁等特点，显著提高现有分析方法的灵敏度。

大量的研究已经证实纳米材料作为有效载体能够透过血脑屏障，其机制可能有以下几方面：①通过在脑微血管壁上的长时间吸附，延长了抗肿瘤药物在脑微血管处的作用时间；②其特定表面活性效应致使脑血管内皮细胞膜的脂质溶解度、细胞膜流动性增强了；③开放血管内皮细胞间的紧密连接；④能够以胞饮的方式被血管内皮细胞吞噬；⑤能够直接穿越透过血管内皮细胞层而进入脑组织；⑥表面修饰剂T-80抑制P-糖蛋白的作用。这些机制可能单独或联合发挥作用。基于纳米材料的这些优势，现在人们开始重视通过纳米技术构建载药系统，将化疗药物或基因靶向到脑肿瘤，进而达到有效治疗肿瘤的目的。

2 展望

目前，运用纳米技术包载紫杉醇的纳米载药系统的构建技术已经成熟。我们前期研究工作已经可以通过乳化溶剂蒸发技术包载紫杉醇得到大小均匀的载药纳米粒子。尽管肿瘤靶向治疗的纳米载体近年来经历了爆发式的发展，迄今为止只有少数的几种纳米载体药物能够通过FDA的批准进入市场，因为这些纳米载体或多或少在潜在毒性、生物相容性、体内稳定性以及载药能力等方面存在着严重的缺陷和挑战。纳米载体携载紫衫醇进入脑内对中枢神经系统的作用机制如何，是否发生与外周神经相同的作用？作用机制如何？这都有待于我们去解决。但我们还要在下面两个方面进一步研究，一、如何将靶向配体、磷脂和荧光标记的纳米金簇结合，实现靶向脑肿瘤和靶向肿瘤微环境，又具有生物检测的特点，降低生产成本，从而构建一种更适合携载紫杉醇的多功能纳米载药系统；二、从分子、细胞和动物水平深入研究其对海马神经元的毒性，利用基因芯片、2-DE等组学技术寻找与紫杉醇相互作用的关键靶蛋白，确定其结构，运用结构生物信息学技术分析其作用网络，推测出紫杉醇调控海马神经元的分子机制，并将关键靶蛋白克隆并转染至海马神经元加以验证。为临床应用紫杉醇多功能纳米粒子治疗脑胶质瘤时，合理用药、降低毒副作用提供理论依据；为设计合成高效、多功能纳米药物提供理论支持和新的思路，同时我们还将为研发具有自主知识产权的新型纳米药物提供新的载体材料。

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李明军(1965～)男 ，黑龙江鹤岗人，学士，主任医师，硕士研究生导师。

荣向辉(1976～)男 ，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生，副主任医师。E-mail：171167108@qq.com。

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