组织CDH1基因异常甲基化和血清HE4检测对卵巢癌和卵巢内异症囊肿的鉴别价值

孙 蓓，张 熊

(1.陕西中医药大学第二附属医院妇二科，陕西 咸阳712000；2.咸阳市第一人民医院检验科，陕西 咸阳712000)

组织CDH1基因异常甲基化和血清HE4检测对卵巢癌和卵巢内异症囊肿的鉴别价值

孙 蓓1，张 熊2

(1.陕西中医药大学第二附属医院妇二科，陕西 咸阳712000；2.咸阳市第一人民医院检验科，陕西 咸阳712000)

目的探讨组织上皮-钙粘连素(CDH1)基因异常甲基化和血清人附睾分泌蛋白4(HE4)检测对卵巢癌和卵巢内异症囊肿的鉴别价值。方法选取卵巢癌患者(卵巢癌组)38例、卵巢内异症囊肿患者(内异症组)41例，另选取子宫或卵巢良性病变患者42例（对照组），采用甲基化聚合酶联反应技术检测CDH1基因启动子区甲基化状态，采用酶联免疫吸附试验检测血清HE4水平。比较以上指标的变化。结果CDH1 DNA在内异症组、卵巢癌组及对照组中的甲基化表达率分别为4.8%(2/41)、39.4%(15/38)、2.3%(1/42)。内异症组的CDH1 DNA甲基化表达率与对照组比较差异无统计学意义(χ2=0.37，P=0.542)，卵巢癌组的CDH1基因甲基化表达率与对照组比较差异有统计学意义(χ2=11.24，P=0.001)，卵巢癌组的CDH1基因甲基化表达率与内异症组比较差异有统计学意义(χ2=13.79，P=0.000)。血清HE4在内异症组、卵巢癌组及对照组水平分别为52.7 pmol/L、537.2 pmol/L、50.3 pmol/L，内异症组血清HE4水平与对照组比较差异无统计学意义(t=0.63，P=0.532)，卵巢癌组的血清HE4水平与对照组比较显著增高，差异有统计学意义(t=54.27，P=0.000)，卵巢癌组与内异症组比较显著增高，差异有统计学意义(t=55.33，P=0.000)。卵巢癌组CDH1基因甲基化DNA表达量与血清HE4水平具有相关性（r=0.527，P＜0.01)，卵巢癌组CDH1甲基化DNA表达量、血清HE4水平分别与CA125水平具有相关性(r=0.539、0.520，P＜0.01)。内异症组血清HE4水平与CA125水平无明显相关性(r=0.127，P＞0.05)。结论联合检测组织CDH1 DNA甲基化的发生和血清HE4水平可应用于卵巢内异症囊肿和卵巢癌的鉴别诊断，提高两种疾病的诊断率。

卵巢癌；卵巢内异症囊肿；CDH1基因；甲基化；HE4

子宫内膜异位症(内异症)是妇科常见病和多发病。内异症病灶最容易侵犯卵巢，可有粘连性肿块及直肠子宫凹陷结节，临床上卵巢内异症囊肿与卵巢恶性肿瘤较难鉴别[1]。组织上皮-钙粘连素1(CDH1)基因异常甲基化以及人附睾分泌蛋白4(HF4)作为一种卵巢肿瘤标志物用于卵巢癌的诊断已经引起了人们的广泛关注。本文通过测定79例卵巢内异症囊肿和卵巢癌组织HF4水平和CDH1基因甲基化表达率，旨在探讨这两种分子标志物在鉴别这两种疾病中的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年1月至2014年10月在我院因盆腔包块住院手术的患者79例，根据术后石蜡切片病理报告将患者分为卵巢癌组38例、卵巢内异症囊肿(内异症组)41例。卵巢癌组患者年龄35～75岁，平均55.3岁；根据2000年FIGO分期，中晚期病例29例，早期病例9例；浆液性囊腺癌20例，黏液性囊腺癌11例，子宫内膜样癌5例，透明细胞癌2例。内异症组患者年龄22～49岁，平均33.8岁；增殖期患者21例，分泌期20例。对照组为选取因子宫疾病或卵巢良性病变行手术的患者，患者年龄33～60岁，平均51.2岁。所有研究对象术前3个月内无任何激素治疗及雌激素依赖性疾病，所有组织标本置于-80℃冰箱保存待用。

1.2 标本采集及处理 卵巢癌组、内异症组患者于术前，对照组妇女于体检时均空腹抽取静脉血3～5ml，3000 r/min离心15min，取上层血清分装于聚丙烯EP管内，储存于-80℃冰箱保存待用。

1.3 检测方法 采用甲基化聚合酶联反应技术检测CDH1基因启动子区甲基化状态，采用酶联免疫吸附试验检测血清HE4水平。组织CDH1基因甲基化：内异症和卵巢癌患者卵巢组织CDH1DNA提取自石蜡包埋组织，采用美国Qiagen公司试剂盒提取CDH1DNA。DNA经亚硫酸氢钠修饰后在55℃孵育16 h，纯化后加氢氧化钠终止，悬浮于重蒸馏水中备用。反应总体积25 ul，反应条件：95℃，5min→95℃，1min→55℃，1min→72℃，35个循环→72℃，8min→4℃保存。以甲基转移酶SssI处理正常人外周血细胞DNA做为阳性对照，以SssI未处理的正常人外周血细胞DNA作为阴性对照，以重蒸馏水作为空白对照。1000 bp DL2000作为分子质量标记。引物序列：甲基化引物：上游5'-TTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT-3'，下游引物5'-TAACTAAAAATTCACCTAC CGAC-3'，扩增产物110 bp；非甲基化引物：上游5'-TAATTTTAGGTTGAGGGGTTATTG-3'，下游5'-CACAACCAATCAACAACACA-3'，扩增产物100 bp。CDH1甲基化基因经PCR扩增后由限制性内切酶Rsa1消化，经3%琼脂糖电泳，紫外灯下观察结果。CDH1基因甲基化DNA定量检测操作严格按照产品说明书进行。

1.4 统计学方法 数据用SPSS18.0统计软件分析，计数资料比较采用χ2检验，计量资料比较采用t检验，相关性分析采用Pearson法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清CA125水平比较 血清CA125在内异症组、卵巢癌组及对照组中的水平分别为(75.3±13.2)kU/L、629.5±79.7)kU/L、(20.9±6.2)kU/L。内异症组、卵巢癌组的血清CA125水平与对照组比较明显增高，差异有统计学意义(t=30.07，60.01，P=0.000)；卵巢癌组的血清CA125水平与内异症组比较显著增高，差异有统计学意义(t=54.13，P=0.000)。

2.2 各组组织CDH1基因甲基化发生率比较 CDH1在内异症组、卵巢癌组及对照组中的甲基化表达率分别为4.8%(2/41)、39.4%(15/38)、2.3%(1/42)。内异症组的CDH1基因表达率与对照组比较差异无统计学意义(χ2=0.37，P=0.542)，卵巢癌组的CDH1基因甲基化表达率与对照组比较差异有统计学意义(χ2=11.24，P=0.001)，卵巢癌组的CDH1基因甲基化表达率与内异症组比较差异有统计学意义(χ2=13.79，P=0.000)。

2.3 各组组织CDH1 DNA甲基化表达量结果比较 CDH1在内异症组、卵巢癌组及对照组中的甲基化表达量分别为(0.20±0.04)、(0.51±0.1)、(0.19±0.03)。异位内膜组的CDH1DNA甲基化表达量与对照组比较差异无统计学意义(t=1.72，P=0.093)，卵巢癌组的CDH1甲基化表达量与对照组比较差异有统计学意义(t=26.81，P=0.000)，卵巢癌组的CDH1甲基化表达量与内异症组比较差异有统计学意义(t=25.00，P=0.000)。

2.4 各组血清HE4水平比较 血清HE4在内异症组、卵巢癌组及对照组中的水平分别为52.7 pmol/L、537.2 pmol/L、50.3 pmol/L。内异症组的血清HE4水平与对照组比较差异无统计学意义(t=0.63，P=0.532)，卵巢癌组的血清HE4水平分别与内异症组、对照组比较显著增高，差异有统计学意义(t=55.33，54.27，P=0.000)。

2.5 相关性分析 卵巢癌组CDH1基因甲基化DNA表达量与血清HE4水平具有相关性(r=0.527，P＜0.01)，卵巢癌组CDH1甲基化DNA表达量、血清HE4水平分别与CA125水平具有相关性(r=0.539，0.520，P＜0.01)。内异症组血清HE4水平与CA125水平无明显相关性(r=0.127，P＞0.05)。利用ROC曲线来评价各项标志物的价值，卵巢癌组以内异症组为参照，血清HE4水平的AUC为0.938(P＜0.01)，组织CDH1 DNA甲基化表达量的AUC为0.719(P＜0.01)。联合检测血清HE4和组织CDH1DNA甲基化发生率的AUC为0.953(P＜0.01)，即血清HE4和组织CDH1 DNA甲基化发生率在鉴别卵巢癌与内异症疾病中有诊断意义。单独检测血清HE4和组织CDH1DNA甲基化发生率分别用于诊断卵巢内异症囊肿时，以对照组为参照的AUC分别为0.239，0.253(P＞0.05)，即单独检测血清HE4和组织CDH1DNA甲基化发生率无独立诊断卵巢内异症囊肿的意义。

2.6 敏感度和特异度分析 当特异度为95%、内异症组以对照组为参照时，血清HE4和组织CDH1 DNA甲基化表达发生率诊断内异症囊肿的敏感度分别为13.7%、7.0%；同样，在特异度为95%、卵巢癌组以内异症组为参照时，两标志物诊断卵巢癌的敏感性为83.2%、52.6%，而联合检测的敏感度为87.9%。

3 讨 论

HE4在人附睾上皮细胞中最早被发现，被认为是附睾特有的、与精子成熟有关的蛋白质[2]。Galgano等[3]研究认为HE4在正常的卵巢上皮细胞中不表达，而在卵巢浆液性癌及卵巢子宫内膜样癌细胞中有高表达，因此HE4可作为诊断卵巢癌的一种血清标志物，尤其对于早期卵巢癌的诊断[2]。还有报道认为，HE4也可以作为诊断子宫内膜癌的标志物[4]。HE4在内异症病灶组织能否表达尚不明确，国内有报道显示，卵巢内异症囊肿患者血清HE4水平并无升高[5]。本研究结果显示，血清HE4水平在卵巢内异症组没有增高(P＞0.05)，而在卵巢癌组则显著增高(P＜0.01)，通过ROC工作曲线分析显示HE4在鉴别卵巢癌与内异症疾病中有诊断意义(P＜0.01)，以上提示血清HE4可以作为鉴别诊断卵巢内异症囊肿和卵巢癌的依据。

DNA甲基化的改变在肿瘤的发生过程中发挥重要作用，其在肿瘤的早期和晚期都会出现，高甲基化诱导沉默抑癌基因，低甲基化促进原癌基因激活，促进肿瘤发展[6]。卵巢癌的发生与DNA高甲基化密切相关，有研究认为，在正常卵巢组织中细胞粘附基因CDH1等呈非甲基化状态，而在卵巢癌组织中出现高甲基化[7]。沈文静等[8]采用甲基化特异性聚合酶链反应法检测63例原发性卵巢上皮癌和41例盆腔转移性卵巢癌患者组织CDH1基因启动子区甲基化状态，结果发现两病例组的CDH1基因启动子区甲基化的发生率分别为28.6%和39%，显著高于对照组。本研究结果显示，卵巢癌组DNA甲基化发生率及甲基化DNA表达量均高于内异症组及对照组(P＜0.01)，内异症组及对照组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。ROC工作曲线分析也和本研究结果相符。据此推测，CDH1基因的异常甲基化在卵巢癌的发生过程中起要作用，其在子宫内膜的非甲基化状态提示CDH1基因甲基化发生的检测可用于卵巢内异症囊肿和卵巢癌的鉴别诊断。

组织CDH1 DNA甲基化的发生和血清HE4水平具有相关性，在卵巢癌组两种标志物分别与CA125水平也有相关性，提示CDH1 DNA甲基化的发生和HE4可能与卵巢癌的发生和发展相关。本文研究显示卵巢组CDH1 DNA甲基化的发生和HE4水平检测较子宫内膜组有更高的灵敏性，因此联合检测组织CDH1 DNA甲基化的发生和血清HE4水平可应用于卵巢内异症囊肿和卵巢癌的鉴别诊断，提高两种疾病的诊断率。

[1]谢 幸,苟文丽.妇产科学[M].8版.北京:人民卫生出版社,2013:324.

[2]Moore RG,Brown AK,Miller MC,et al.The use of multiple novel tumor biomarkers for the detection of ovarian carcinoma in patients with a pelvic mass[J].Gynecol Oncol,2008,108(2):402-408.

[3]Galgano MT,Hampton GM,Frierson HF Jr.Comprehensive analysis of HE4 expression in normal and malignant human tissues[J]. Mod Pathol,2006,19(6):847-853.

[4]Moore RG,Brown AK,Miller MC,et al.Utility of a novel serum tumor biomarker HE4 in patients with endometrioid adenocarcinoma of the uterus[J].Gynecol Oncol,2008,110(2):196-201.

[5]刘亚南,叶 雪,程洪艳,等.人附睾分泌蛋白4联合CA125在卵巢恶性肿瘤与子宫内膜异位症鉴别诊断中的价值[J].中国妇产科杂志,2010,45(5):363-366.

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[7]于 歌,王 晶.卵巢癌DNA甲基化的研究进展[J].实用肿瘤学杂志,2013,27(1):81-84.

[8]沈文静,郭科军,戴冬秋,等.CDH1基因异常甲基化在上皮性卵巢癌中的检测及临床意义[J].中国实用妇科和产科杂志,2007,23(7):520-522.

Value of abnormal methylation of CDH1 gene and the detection of serum HE4 in the identification of ovarian cancer and ovarian endometriosis cyst.

SUN Bei1,ZHANG Xiong2.1.The Second Departerment of Gynaecology,the Second Affiliated Hospital of Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Xianyang712000,Shaanxi,CHINA;2 Department of Clinical Laboratory,the First People's Hospital of Xianyang City,Xianyang712000,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the abnormal methylation of CDH1 gene and the detection of serum human epididymis protein4(HE4)in the identification of ovarian cancer and ovarian endometriosis cyst.MethodsThirty-eight patients with ovarian cancer(group A),41 patients with ovarian ectopic cyst(group B)and42 patients with benign uterine or ovarian lesion(the control group)were enrolled in the study.The methylation status of CDH1 gene promoter region was detected by methylation-specific polymerase chain reaction,and the levels of serum HE4 were detected with enzyme-linked immunosorbent assay.The changes of the above indicators were compared.ResultsThe expression rates of CDH1 DNA methylation in group B,group A,control group were4.8%(2/41),39.4%(15/38),2.3%(1/42),respectively,with no statistically significant difference between group B and the control group(χ2=0.37,P=0.542),but statistically significant difference between group A and the control group(χ2=11.24,P=0.001),as well as between group A and group B(χ2=13.79,P=0.000).The levels of serum HE4 in group B,group A and control group were52.7 pmol/L,537.2 pmol/L,50.3 pmol/L,respectively,with no statistically significant difference between group B and the control group(t=0.63,P=0.532),but statistically significant difference between group A and the control group(t=54.27,P=0.000),as well as between group A and group B(t=55.33,P=0.000).In group A,the DNA expression quantity of CDH1 gene methylation and levels of serum HE4 are correlated(r=0.527,P＜0.01),which are respec-tively correlated to CA125 levels(t=0.539,0.520,P＜0.01).In group B,the levels of serum HE4 had no correlation with CA125 levels(r=0.127,P＞0.05).ConclusionJoint detection of CDH1 gene methylation and serum HE4 levels can be applied to the differential diagnosis between ovarian endometriosis cyst and ovarian cancer,which improves the diagnosis rate of the two kinds of diseases.

Ovarian cancer;Ovarian endometriosis cyst;CDH1 gene;Methylation;HE4

R737.31

A

1003—6350（2015）20—3023—03

2015-02-28)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.20.1100

孙 蓓。E-mail：liyaping0080@126.com