CD40 siRNA 对MRL/Lpr 小鼠狼疮肾炎的治疗作用①

庞春艳 吕凤凤 尹芳蕊 王永福

(内蒙古科技大学包头医学院风湿免疫研究所包医一附院风湿免疫科，内蒙古自治区自体免疫学重点实验室，包头014010)

系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)是一种可累积多系统、多器官的自身免疫性疾病，以肾脏受累多见，SLE 患者出现肾脏损害称为狼疮肾炎(Lupus Nephritis，LN)，对LN 的治疗，若临床症状轻微，肾小球结构正常或轻微病变，可用抗疟药阿司匹林或NSAID 等治疗，同时加用小剂量激素口服;若肾小球病变严重时，可采用激素加细胞毒药物治疗。SLE 患者合并LN 时预后较差，LN 的主要死因是肾功能衰竭和合并感染。如果及时地控制LN 的发展可延长SLE 患者的5 年存活率。

小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)是一种特定基因沉默技术，广泛用于肿瘤、自身免疫性疾病和肝炎等疾病的治疗［1-3］，而且小鼠体内研究发现，口服siRNA 制剂对小鼠不会造成任何的不良反应［4］。因此，本研究采用siRNA 技术沉默MRL/Lpr 小鼠中CD40 基因的表达，探讨CD40 基因的siRNA 对MRL/Lpr 小鼠的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 载体pGFP-V-RS 购自美国Origene 公司，AxyPrep 质粒DNA 大量抽提试剂盒购自美国Axygen 公司，TRIzol 购自日本Takara 公司，M-MLV 逆转录酶和脂质体lipofectamineTM2000 购自美国Invitrogen 公司。

1.2 siRNA 的设计和CD40-siRNA 是否在小鼠肾脏中表达 针对CD40 基因的cDNA 序列设计2 段siRNA。第1 段序列为:CTTGGAGGTCCTACAGAAA，第2段序列为:GTGTTATCCCTGGACAAGC。将上述序列的模板插入质粒载体pGFP-V-RS 中，构建其真核表达载体。将构建好的60 μg CD40 siRNA1 和脂质体lipofectamineTM2000 的混合物200 μl［DNA(μg):lipofectamineTM2000 (μl)为1∶2］分别自尾静脉注射MRL/Lpr 小鼠，对照组小鼠注射等剂量、等比例的磷酸盐缓冲液(PBS)和lipofectamineTM2000 的混合物，6 h 后处死小鼠取肾脏，快速冰冻切片，荧光显微镜下观察是否有绿色荧光。

1.3 实验动物分组及给药 12 周龄MRL/Lpr 雌性小鼠16 只，体质量18～23 g，购南京大学动物模式研究所。按照简单随机化分组方法将小鼠分为对照组、空载体组、CD40 siRNA1 组和CD40 siRNA2 组4组，每组4 只。注射方法同上，空载体组小鼠注射载体pGFP-V-RS 与lipofectamineTM2000 的混合物。每隔1 天1 次，共6 次。

1.4 各项指标的检测 注射后14 d 处死所有组MRL/Lpr 小鼠，心脏取血，分离血清。-80℃保存。取小鼠肾脏，分成两份，其中一份TRIzol 提RNA，实时荧光定量PCR 检测小鼠肾脏中CD40 mRNA 的表达水平，根据ct 值计算2-ΔΔct。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，CD40 上游引物:5'-GAGAAGACCCAATGCCACC-3'，下游引物:5'-GCACATGCCTCGCAATCC-3'，内参β-actin 上游引物:5'-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3'，下游引物:5'-ATGTCACGCACGATTTCC-3'。另一份肾脏，4% 甲醛固定，石蜡包埋，切2 张片，分别作HE 染色和荧光免疫组织化学染色，荧光免疫组织化学染色的图片采用IPP6 软件分析平均A 值。

1.5 统计学分析 采用SPSS17.0 统计软件进行数据分析，以±s 表示，组间的比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 CD40 siRNA 真核表达载体在肾脏中的表达

由于本实验用到的质粒载体pGFP-V-RS 含有绿色荧光蛋白，因此荧光显微镜下观察冰冻切片，结果发现:对照组小鼠肾脏中看不到绿色荧光，而CD40-siRNA1 组可看到明显的绿色荧光，即CD40 siRNA真核表达载体可以在MRL/Lpr 小鼠肾脏中表达，见图1。

图1 CD40 siRNA 真核表达载体在小鼠肾脏中的表达Fig.1 Expression of CD40 siRNA in kidney from MRL/Lpr mice

2.2 4 组小鼠CD40 siRNA 注射后CD40 mRNA的表达水平 注射后14 d 处死小鼠，CD40-siRNA1 组和CD40-siRNA2 组小鼠肾脏中CD40 mRNA 的表达明显低于对照组和空载体组，差异有统计学意义(P＜0.05)，对照组和空载体组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)，CD40-siRNA1 组和CD40-siRNA2 组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.3 4 组小鼠CD40 siRNA 注射后CD40 蛋白的表达水平 注射后14 d 处死小鼠，检测4 组小鼠肾脏中CD40 蛋白的表达，结果显示:对照组和空载体组有很强的红色荧光，而CD40-siRNA1 组和CD40-siRNA2 组的红色荧光量明显减弱，即CD40-siRNA1组和CD40-siRNA2 组CD40 的表达明显低于对照组和空载体组，对照组和空载体组比较差异不明显，siRNA1 组和siRNA2 组比较也无明显差异。见图2(附:上述应用的为荧光免疫组化，无需染色，放大倍数为10 倍)。

2.4 4 组小鼠的病理改变 光镜下观察肾脏的病理切片，结果发现:对照组的肾小球炎性细胞浸润，肿大，肾小管肿胀，可见管型，空载体组与对照组的病理类型一致，而CD40-siRNA1 组和CD40-siRNA2组中的小鼠肾脏病理显示:肾小球和肾小球浸润的炎性细胞减少，肾小管肿胀程度减轻，见图3。

表1 4 组小鼠肾脏中CD40 mRNA 表达水平(±s)Tab.1 Expression levels of CD40 mRNA in kidney from MRL/Lpr mice(±s)

表1 4 组小鼠肾脏中CD40 mRNA 表达水平(±s)Tab.1 Expression levels of CD40 mRNA in kidney from MRL/Lpr mice(±s)

Note:Compared with control group and empty vector group，1)P＜0.05.

图2 4 组小鼠肾脏中CD40 蛋白的表达水平Fig.2 Expression levels of CD40 protein in kidney from MRL/Lpr mice

2.5 4 组小鼠CD40 siRNA 注射后24 h 尿蛋白的变化 24 h 尿蛋白检测结果显示:CD40-siRNA1 组和CD40-siRNA2 组中的小鼠24 h 尿蛋白的 浓 度 分 别 为(202.50 ± 26.30)mg/dl 和(201.25 ±28.39)mg/dl 显著低于对照组和空载体组狼疮鼠的浓度，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

2.6 4 组小鼠CD40 siRNA 注射后补体C3 的表达水平 注射后14 d 处死小鼠，CD-40 siRNA1组和CD-40 siRNA2 组小鼠血清中补体C3 的表达明显高于对照组和空载体组，差异有统计学意义(P＜0.05)，对照组和空载体组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)，CD-40 siRNA1 组和CD-40 siRNA2 组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。见图4。

图3 4 组小鼠肾组织病理学改变(HE，×200)Fig.3 Changes of renal histopathology in MRL/Lpr mouse (HE，×200)

表2 4 组小鼠24 h 尿蛋白的浓度(±s，mg/dl)Tab.2 Urinary Protein content of MRL/Lpr mice in 4 groups(±s，mg/dl)

表2 4 组小鼠24 h 尿蛋白的浓度(±s，mg/dl)Tab.2 Urinary Protein content of MRL/Lpr mice in 4 groups(±s，mg/dl)

Note:Compared with control group and empty vector group，1)P＜0.05.

图4 4 组小鼠补体C3 的表达水平Fig.4 Expression level of complement C3 in serum of MRL/Lpr

3 讨论

LN 是SLE 累及肾脏所引起的一种免疫复合物性肾炎，除SLE 全身表现外，临床主要表现为不同程度的蛋白尿、血尿、肾功能不全等，可表现为不同的病理学分类。人类白细胞分化抗原CD40 是与T细胞和B 细胞功能有关的一种表面抗原。CD40 与其配体CD40L 形成信号通路在自身免疫炎症中起重要作用［5，6］。同时，CD40 还可激活SLE 患者B 细胞，使其增殖和分化能力增强，免疫球蛋白(IgS)分泌增多［7］。

本研究将2 段CD40 的siRNA 真核表达载体尾静脉注射MRL/Lpr 小鼠，6 h 后处死小鼠取肾脏制作冰冻切片，荧光显微镜下观察发现MRL/Lpr 小鼠肾脏可见绿色荧光，说明CD40 siRNA 真核表达载体可在小鼠肾脏中表达。CD40 的mRNA 和蛋白水平的检测结果发现:CD40 的特异性siRNA 可抑制MRL/Lpr小鼠肾脏中CD40 在mRNA 和蛋白水平的表达。

LN 肾脏病理可见肾小球有大量中性粒细胞浸润、肿胀，肾小管出现空泡样改变和管型，是SLE 主要的合并症和死亡原因。MRL/Lpr 小鼠会出现轻中度蛋白尿和进行性肾损害，病理表现为炎细胞浸润、血管炎以及间质小管病变，肾小球系膜和血管环中可见呈轻微颗粒型IgG 免疫复合物和补体C3，与人类LN 相似［8］。本研究狼疮鼠肾脏病理切片显示，模型组的肾小球肿胀，且有大量淋巴细胞浸润，肾小管出现空泡样改变，符合LN 肾脏的病理改变。MRL/Lpr 小鼠尾静脉注射CD40 的特异性siRNA 后可发现肾小球肿胀减轻，淋巴细胞浸润减少，肾小管空泡样改变减轻，而注射空载体的狼疮鼠肾脏却没有这样的改变，空载体组肾脏的病理改变和模型组基本一致，没有明显变化。这说明CD40 的siRNA可逆转LN 的肾脏病理改变。

SLE 患者合并LN 时会出现不同程度的蛋白尿，如及时合理地进行治疗蛋白尿的程度可以逐渐减轻。Luo 等［9］将B 淋巴细胞诱导成熟蛋白1(B lymphocyte-induced maturation protein-1，Blimp-1)的siRNA 载体注射MRL/Lpr 小鼠，结果发现，Blimp-1的siRNA 可减轻抗dsDNA 抗体的滴度，减少24 h尿蛋白的含量，减弱SLE 的相关症状等。本研究在CD40 siRNA 注射MRL/Lpr 小鼠尾静脉后，结果显示:24 h 尿蛋白的含量较模型组和空载体组明显减少，差异有统计学意义。这提示CD40 的siRNA 可减少MRL/Lpr 小鼠的24 h 尿蛋白的含量。

SLE 患者由于形成大量循环免疫复合物，补体被大量消耗，其下降程度与病情活动程度呈平行关系，患者表现为低补体血症。免疫复合物沉积肾小球可引起狼疮肾炎，临床上通常将补体C3 作为判断狼疮肾炎活动度的指标［10，11］。本研究结果显示:CD40 的siRNA 可以升高MRL/Lpr 小鼠血清中补体C3 水平。提示CD40 的siRNA 在一定程度上可以减轻狼疮小鼠体内的免疫反应，减轻LN 的活动度。

总之，CD40 的siRNA 真核表达载体尾静脉注射MRL/Lpr 小鼠后，CD40 siRNA 可以在其肾脏中表达，可减少CD40 mRNA 和蛋白的表达水平，同时减少24 h 尿蛋白的含量，逆转肾脏的病理改变，进一步还可升高MRL/Lpr 小鼠体内的补体C3 水平，缓解LN 的活动度，因此，CD40 siRNA 对LN 有治疗作用。

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