过表达ALEX1 对乳腺癌MCF-7 细胞增殖和凋亡的影响①

曾 帆 高 月 伍家燕 李海玉 樊建军 李 韵 张寒韬 刘革力 宋方洲

(重庆医科大学 基础医学院分子肿瘤研究中心，重庆 400016)

ALEX1(Arm proteins lost in epithelial cancers on chromosome X1)蛋白是Arm 重复蛋白家族成员之一，蛋白序列中含有两个Armadillo repeat 结构，在蛋白N 端具有一个疏水的跨膜区［1］。Armadillo repeat 结构首次发现于果蝇极性基因armadillo，该基因在果蝇胚胎形成、维持上皮组织完整性和早期细胞极性形成中起重要作用，Arm repeat 家族在肿瘤形成、发展、细胞间通讯，维持组织完整性等多方面发挥着重要作用［2］。ALEX1 在正常组织中除肝脏、胸腺组织低表达，外周血白细胞未见表达外均有广泛的表达;在上皮组织来源的肿瘤组织中低表达或不表达［3］，提示ALEX1 在上皮组织来源的肿瘤中可能充当抑癌基因起着重要作用。但其在乳腺癌中的研究国内外报道较少。本研究将重组慢病毒LV5-ALEX1 感染乳腺癌 MCF-7 细胞株，旨在探讨ALEX1 基因过表达后对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响，为进一步研究ALEX1 基因在乳腺癌中的作用及其机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 MCF-7 细胞由本实验室保存，ALEX1、GAPDH 引物由TaKaRa 公司合成，RT-PCR 试剂盒和荧光定量PCR 试剂盒SYBRGreen，ExTaq TM 聚合酶Ⅱ购自TaKaRa 公司。转染试剂Lipofectamine 2000 和TRIzol 试剂购自Invitrogen 公司;蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒和ECL 发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;兔抗人ALEX1 多克隆抗体购自Abcam 公司;HRP 标记的山羊抗兔IgG 抗体、兔抗人β-actin 多克隆抗体IgG购自北京中杉生物有限公司。重组慢病毒LV5-ALEX1 购自上海吉玛公司。Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司;流式细胞仪购自BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及感染重组慢病毒 将MCF-7 培养于含10%的胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素的RPMI1640 培养基，37℃、饱和湿度、5%CO2，常规传代培养。制成细胞悬液接种于6孔板中，当细胞长到50%～60%时，加入重组慢病毒LV5-ALEX1 悬液和阴性对照病毒LV5-NC 悬液，继续培养。将LV5-ALEX1 作为实验组，LV5-NC 作为阴性对照组。

1.2.2 Real-time PCR 检测ALEX1 基因的表达 采用TRIzol 试剂盒提取感染过ALEX1 后72 h 的细胞总RNA，按试剂盒标准步骤操作。取1 000 ng 总RNA 进行逆转录，取1 μl 产物为模板进行荧光定量PCR 扩增，ALEX1 上游引物序列:5'-TGATATTCTGAGTGCTCCCGACC-3'，下游引物序列:5'-TGTTACCCAGAGTGACCAAGGCT-3';产物大小101 bp;GAPDH 的上游引物序列:5'-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3'，下游引物序列:5'-GTAGAGGCAGGGATGAGTTCT-3'，产物大小132 bp。PCR 条件:95℃10 s 后，40 个循环(变性95℃5 s、退火60℃15 s、延伸72℃15 s)，最后72℃10 min。每个样本重复三次。通过比较CT 值法(2-△△CT)进行相对定量分析。

1.2.3 Western blot 法检测ALEX1 蛋白及内源性凋亡通路相关蛋白水平的表达 MCF-7 细胞经感染处理72 h 后，收集各组细胞，裂解蛋白，BCA 法定量。取40 μg 蛋白样品，经SDS-PAGE 分离后，电转移至PVDF 膜上，经5% 脱脂奶粉室温封闭2 h;加入兔抗人ALEX1(1∶500 稀释)抗体，Bax(1∶1 000稀释)抗体，BCL-2(1∶1 000 稀释)抗体，Activecaspase3(1∶1 000 稀释)抗体，兔抗人β-actin 多克隆抗体(1∶1 000)，4℃过夜，TBST 洗膜3 次，再分别与HRP 标记的山羊抗兔二抗(1∶3 000)室温孵育2 h，ECL 化学发光。

1.2.4 流式细胞术检测过表达ARMCX1 对MCF-7细胞凋亡的影响 转染72 h 后，胰酶消化各组细胞，用冷PBS 重悬细胞，1 000 r/min 离心5 min，重复1 次，弃上清，再加入1 ml PBS 混匀，转移至1.5 ml EP 管中。加入5 μl Annexin V-FITC，振荡均匀后4℃孵育15 min，再加入5 μl 碘化丙啶(PI)，孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。

1.2.5 CCK8 法测定细胞的生长增殖情况 分别取对数生长期对照组和实验组的细胞，以每孔5000个细胞接种于96 孔板中，每组3 个复孔。在细胞贴壁后每孔加入10 μl CCK8 试剂，37℃孵育2 h，在酶标仪上450 nm 测OD 值。分别检测0、24、48、72、96 h 细胞生长情况。

1.3 统计学分析 应用SPSS17.0 统计软件，数据均以±s 表示。两组数据间的比较采用独立样本t检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 重组慢病毒LV5-ALEX1 感染MCF-7 细胞效率 重组慢病毒感染MCF-7 细胞72 h 后，显微成像系统观察感染效率并拍照。结果显示实验组和对照组感染效率均达到90%以上(图1)。

2.2 MCF-7 细胞经感染后ALEX1 mRNA 和蛋白水平的变化 Real-time PCR 和Western blot 检测结果显示，与阴性对照组相比，实验组ALEX1 基因mRNA 和蛋白表达水平明显升高(P＜0.01)(图2、3)，表明ALEX1 被成功过表达。

图1 荧光倒置显微镜观察MCF-7 细胞转染效率Fig.1 Infection efficiency of MCF-7 by fluorescence microscope

图2 过表达ALEX1 对MCF-7 细胞ALEX1 mRNA 水平影响Fig.2 ALEX1 mRNA expression detected by realtime PCR

图3 过表达ALEX1 对MCF-7 细胞ALEX1 蛋白水平影响Fig.3 ALEX1 protein expression detected by Western blot

图4 过表达ALEX1 对MCF-7 细胞凋亡的影响Fig.4 Apoptotic cell numbers were determined by flowcytometric analysis

2.3 过表达ALEX1 后，MCF-7 细胞凋亡的变化 流式细胞术检测凋亡结果显示:对照组和实验组的凋亡率分别为3.60% ± 1.614% 和20.55% ±2.50%，实验组与对照组比较差异有显著性(P＜0.01)，表明过表达ALEX1 诱导MCF-7 细胞发生凋亡(图4、5)。

2.4 过表达ALEX1 后，MCF-7 细胞的生长变化情况 CCK8 法检测结果显示:过表达ALEX1 48、72、96 h，实验组较对照组MCF-7 细胞的生长明显受到抑制(图6)。

图5 过表达ALEX1 对MCF-7 细胞凋亡影响统计图Fig.5 Percentage of apoptosis in each group

图6 CCK-8 检测过表达ALEX1 对MCF-7 细胞生长的影响Fig.6 Effects of ALEX1 overexpression on cell growth in MCF-7 cells by CCK8

图7 Western blot 检测过表达ALEX1 对内源性凋亡通路相关蛋白的影响Fig.7 ALEX1 regulated the expression of apoptosis proteins

2.5 过表达ALEX1 后，内源性凋亡通路相关蛋白的变化情况 Western blot 检测结果显示:与对照组相比，实验组中Bax 蛋白和Active-caspase3 蛋白表达量升高，BCL-2 蛋白表达量降低(图7)。

3 讨论

ALEX1 蛋白是Kurochkin［1］在用酵母双杂交技术寻找与pp110 蛋白相互作用的蛋白时发现的。编码ALEX1 基因全长为4.2 kb，含有四个外显子，但编码区全部位于第四个外显子上。编码453 个氨基酸，蛋白质分子量为49 kD，含有两个arm repeat 结构。近年研究发现，ALEX1 mRNA 在心脏、脑、睾丸、前列腺、卵巢、结肠等大多正常组织组织中高表达。而在人肿瘤组织如肺癌、前列腺癌以及结肠癌中没有表达，在胰腺癌和卵巢癌低于正常组织的表达［1，3-5］。在肿瘤细胞系中，ALEX1 mRNA 在胶质瘤细胞系和骨肉瘤细胞系中有表达，而在永生上皮细胞系、肺癌细胞系和乳腺癌细胞系中不表达，而在正常的乳腺上皮细胞系中有表达。这些研究表明ALEX1 基因有可能作为一种抑癌基因在肿瘤的发生发展中发挥作用。

为了探讨ALEX1 基因是否作为抑癌基因在乳腺癌细胞中发挥生物学作用。本研究利用重组慢病毒LV5-ALEX1 感染MCF-7 细胞来过表达ALEX1，观察对乳腺癌MCF-7 细胞的生物学行为的影响。2012 年，Hiroyoshi 等［5］报道，ALEX1 能够抑制人直肠癌细胞的克隆形成，说明ALEX1 在直肠癌细胞系中抑制了细胞的增殖能力。本研究的结果发现，感染重组慢病毒LV5-ALEX1 的MCF-7 细胞在48，72，96 小时较阴性对照组细胞生长受到明显抑制，与文献报道一致，说明ALEX1 在乳腺癌的发病机制中可能扮演抑癌基因的角色。

细胞凋亡又称程序性死亡，是机体为了调控自身发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。细胞凋亡参与机体许多病理生理过程，是抑制细胞增殖的一个重要原因［6］。本研究流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，过表达ALEX1 细胞凋亡率显著增加，说明ALEX1 能够诱导MCF-7 细胞发生凋亡。凋亡的产生受多种凋亡通路调控，其中重要的凋亡通路是线粒体调节的内源性凋亡信号通路。Bcl-2 基因家族在此凋亡通路中起着重要的作用，该家族包括抑制凋亡基因Bcl-2 和Bcl-xL，以及促凋亡基因Bax 和Bad［7，8］。其中Bax 的过表达可以促进细胞发生凋亡［9，10］，然而，Bcl-2 的过表达却能抑制Bax 引起的细胞凋亡的功能［11］。Bax/Bcl-2比率的升高导致线粒体膜通透性增加引起细胞色素c 的释放，最终激活Caspase3［12］。Caspase3 是半胱氨酸蛋白酶家族中导致细胞凋亡的最强大的最终效应因子，Caspase3 的激活最终诱导细胞发生凋亡［13］。本研究发现在乳腺癌MCF-7 细胞中过表达ALEX1，引起Bax 蛋白表达增加和激活Caspase3，同时降低了BCL-2 的蛋白表达量，我们推测ALEX1 很有可能通过上调Bax 蛋白的表达和降低BCL-2 的蛋白表达打开内源性凋亡通路的阀门，使得Caspase3活化，最终导致细胞发生凋亡。

本研究首次报道ALEX1 通过诱导细胞凋亡来抑制细胞的增殖，为进一步研究ALEX1 在肿瘤发生发展中作用机制奠定了理论基础。同时，对ALEX1的深入研究有望推动以ALEX1 为治疗靶点的药物开发和基因检测技术的研发。

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