猪苓多糖诱导M2 亚型巨噬细胞向M1 巨噬细胞转化①

江泽波 赵 晋 李思明 胡金萍 曾 星

(广州中医药大学第二附属医院，广州 510006)

多糖可活化机体免疫细胞，调节白介素及肿瘤坏死因子等细胞因子分泌，在机体抗肿瘤免疫调节等方面备受关注［1，2］，是目前常用的免疫调节剂。近期相关研究表明，猪苓多糖可以通过TLR4 信号通路活化巨噬细胞，刺激TNF-α、IL-1β 等炎症因子分泌，并提高膀胱癌大鼠腹腔巨噬细胞CD86、CD40的阳性表达率［3-5］，但其对肿瘤相关巨噬细胞作用机制尚未明确。而肿瘤相关巨噬细胞类似于M2 亚型巨噬细胞，两者均具有抗炎、降低肿瘤杀伤来保护机体［6-8］。本文借助肿瘤相关的M2 亚型巨噬细胞模型，观察猪苓多糖对M2 亚型巨噬细胞膜表面分子和相关炎症因子的作用，探讨猪苓多糖启动巨噬细胞可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠巨噬细胞系RAW264.7 为广东省中医院中心实验室提供。含丙酮酸钠的高糖DMEM培养基、双抗(Gibco)、胎牛血清(FBS)购于Hyclone 公司，TRIZOL 试剂购于Invitrogen 公司、逆转录试剂盒(Thermo)、荧光定量PCR 试剂盒(罗氏);流式抗体:CD16/32-FITC(ABCCM)，CD40-PECY5，大鼠IGg-FITC(eBiscience)，Rat IgG2a K Isotype Control PE-Cy5(eBioscience)，Rat IgG2a K Isotype Control RPE(ABCAN，USA)Rat IgG2a K Isotype Control FITC(eBioscience)，异丙醇、无水乙醇、氯仿(广州化学试剂厂)，IL-4(Peprotech，USA);流式抗体CD23-PECY5，CD206-RPE(ABCAN，USA)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 小鼠巨噬细胞株RAW264.7 用含100 ml/L 胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 氯霉素的高糖DMEM 培养基37℃，50 ml/L CO2培养。实验分为:空白对照组，IL-4 诱导的M2 亚型巨噬细胞，IL-4 +猪苓多糖低、中、高剂量组，猪苓多糖剂量分别为终浓度分别为50、100、200 μg/ml 的PPS 处理。

1.2.2 IL-4 诱导巨噬细胞株RAW264.7 为M2 亚型巨噬细胞及其检测 M2 亚型巨噬细胞模型的构建，根据文献［9］研究，给予终浓度为20 ng/ml 的细胞因子IL-4 诱导巨噬细胞株RAW264.7 极化为替代活化形式的M2 模式的巨噬细胞亚型。诱导24 h，然后收集细胞上清，PBS 洗涤巨噬细胞，消化调整数于流式管当中，加入2 ml 的PBS 洗涤细胞2 次，离心去掉上清，加入PBS 200 μl 重悬细胞，然后加入相应的抗体CD23-PECY5、CD206-RPE 和CD16/32-FITC 各1 μl，对应的同型作为阴性对照。4℃避光孵育30 min，然后PBS 离心去除游离的流式抗体，500 μl PBS 重悬细胞，于流式细胞仪中检测相关膜表面分子的阳性表达率，膜表面分子蛋白特异性验证M2 亚型巨噬细胞的极化成功。同时TRIZOL收集巨噬细胞，以qRT-PCR 检测ARG1、IL-10、TGFβ、iNOSmRNA 的相对表达量，进一步验证M2 亚型的构建成功。

1.2.3 猪苓多糖对M2 亚型巨噬细胞膜分子的影响 诱导小鼠巨噬细胞株RAW264.7 为M2亚型巨噬细胞后，给予相应的不同浓度的猪苓多糖溶液干预24 小时，收集细胞，PBS 洗涤细胞2次，调整细胞浓度，加入相应的流式抗体CD16/32、CD206、CD40 各1 μl，避光孵育30 min，然后加入PBS 洗去游离的流式抗体，加入500 μl 的PBS 溶液重悬细胞，用流式细胞仪检测细胞的膜分子的表达量。

1.2.4 qRT-PCR 检测猪苓多糖对M2 亚型巨噬细胞细胞因子mRNA 的影响 IL-4 刺激24 h 的巨噬细胞去上清，加入相应的药物进行干预24 h，然后每孔加入1 ml 的TRIZOL 反复吹打，收集细胞于无酶的1.5 ml 的EP 管当中，-80℃保存或者继续提取总RNA。按照试剂说明提取总RNA，然后用紫外分光光度计检测RNA 浓度和纯度，按1 μg 的总RNA逆转录合成cDNA，以cDNA 为模板进行扩增iNOS，IL-1β，IL-10，TNF-α mRNA 的基因编码片段。基因引物序列分别为 mus-GAPDH Forward-5'-GTTTTCAG-GGATGAAGCGGC-3'，Reverse-5'-TGGGATAGGGCC-TCTCTTGC-3';IL-10Forward-5'-TACTCGGCAAACC-TAGTGCG-3'，Reverse-5'-GTGTCCCAACATTCATAT-TGTCAGT-3';IL-1β Forward-5'-TGGGATAGGGCC-TCTCTTGC-3'，Reverse-5'-CCATGGAATCCGTGTC-TTCCT-3';TNF-ɑ Forward-5'-GTGTCCCAACATTCA-TATTGTCAGT-3'，Reverse-5'-TGGGAAGAGAAACC-AGGGAGA-3';iNOS Forward-5'-TGAGTTCCGAAGCAAGCCAA-3'，Reverse-5'-AGACCTCAACAGAGCC-CTCA-3'，ARG1 Forward-5'-TACAAGACAGGGCTCCTTTCAG-3'，Reverse-5'-TGAGTTCCGAAGCAAGC-CAA-3'。按照实时荧光定量PCR(Real-time PCR)试剂盒的说明:2 × SYBR Green 10 μl、上下游引物终浓度0.4 μmol/L、cDNA模板10 μl、DEPC 水12 μl，反应总体系为20 μl。按照扩增试剂盒的程序:欲变性95℃10 min，变性95℃15 s，60℃34 s 退火，45 个循环。以GAPDH 作为内参，采用2-ΔΔCT法计算相对基因的表达量。

1.3 统计学分析 应用SPSS17.0 统计软件，采用单因素方差分析对实验数据进行处理，以P ＜0.05值为差异有显著性。

2 结果

2.1 IL-4 诱导巨噬细胞极化为M2 鉴定指标 实验结果如表1、图1 所示，给予IL-4 诱导24 h 后，和未刺激的RAW64.7 比较，CD16/32 表达水平略高，但和空白对照组比较，差异无统计学意义(P ＞0.05);而CD206分子表达显著增高(P ＜0.05)，提示IL-4 诱导M2 亚型巨噬细胞成功。

表1 IL-4 诱导RAW64.7 极化为M2 亚型膜分子表达的情况(n=3，%)Tab.1 Expression of membrane surface molecules on IL-4-induced M2 macrophages(n=3，%)

图1 IL-4 诱导的M2 亚型巨噬细胞膜表面分子CD206 和CD16/32 的阳性表达率Fig.1 Expression of CD206 and CD16/32 on IL-4-induced M2 macrophages

图2 IL-4 诱导的M2 亚型巨噬细胞mRNA 表达量Fig.2 Expression of mRNA on IL-4-induced M2 macrophages

表2 猪苓多糖对M2 亚型巨噬细胞膜分子表达的影响(n=3，%)Tab.2 Expression of membrane surface molecules of PPS on IL-4-induced M2 macrophages(n=3，%)

表3 猪苓多糖对IL-4 诱导的模型细胞因子mRNA 的影响(n=3)Tab.3 Expression of mRNA of PPS on IL-4-induced M2 macrophages(n=3)

2.2 qRT-PCR 鉴定IL-4 诱导巨噬细胞极化为M2亚型巨噬细胞 如图2 所示，给予IL-4 诱导巨噬细胞24 h 后，和空白对照组比较，ARG1 mRNA 的表达量明显升高［(2.88±0.08)倍，P ＜0.01)］，IL-10 mRNA 的相对表达量升高了(1.89±0.15)倍，(P ＜0.01)，TGF-β mRNA 的相对表达量升高了(3.95±0.37)倍，iNOS 减低到(0.605±0.09)，和空白对照组比较，差异均具有统计学意义(P ＜0.01)。

2.3 猪苓多糖对M2 亚型巨噬细胞膜分子的影响给予猪苓多糖干预后，CD206 的表达量降低，CD16/32、CD40 的表达量升高，剂量依赖性明显，和模型组比较，差异具有统计学意义(P ＜0.01)，详见表2。

2.4 猪苓多糖对M2 亚型巨噬细胞模型细胞因子mRNA 的影响 从表3 可知:巨噬细胞模型予猪苓多糖干预后，相应的炎症因子TNF-α、IL-1βmRNA的表达量升高，特异性M1 指标iNOS mRNA 呈现相似的趋势，两者与模型组比较，差异具有统计学意义(P ＜0.01);IL-10 的表达量随着猪苓多糖剂量的升高而呈正相关趋势。综上可推测猪苓多糖通过提高炎症因子的相对表达量来调节M2 亚型巨噬细胞生物活性。

3 讨论

巨噬细胞是一种具有可塑性和多能性的细胞群体［10］，体内外局部微环境的不同直接影响巨噬细胞的分化和功能差异［11，12］，目前主要极化两种亚型:经典M1 亚型(Classical activated macrophage)和替代M2 亚型(Alternative activated macrophage)，其中M1 亚型主要以抗肿瘤和增强免疫为主，M2 亚型则具有抗炎和介导肿瘤免疫逃逸作用。肿瘤微环境倾向于诱导巨噬细胞向M2 优势活化，作为肿瘤组织中数量最多的抗原提呈细胞，M2 亚型巨噬细胞仅有较弱的抗原提呈能力，高表达CD23、CD206 等膜表面分子，并通过分泌抑制性细胞因子IL-10、TGFβ 等下调免疫应答，降低炎症因子过表达对机体的损害［13，14］。在体外培养条件下，通过Th2 型细胞因子(如IL-4、IL-13 等)可诱导产生M2 亚型巨噬细胞［9］，并与体内极化的巨噬细胞具有高度相似的表型和功能，这也是目前研究巨噬细胞异质性的重要手段。

本研究采用经典的Th2 型细胞因子IL-4 诱导RAW264.7 巨噬细胞株24 h，极化后的巨噬细胞高表达M2 特异性的标志物ARG1，表明IL-4 诱导M2亚型巨噬细胞有效可行。造模成功后给予不同剂量的猪苓多糖干预，IL-10 等抑制性炎症因子表达升高，并与浓度呈正相关，且M1 型巨噬细胞特异性的指标iNOSmRNA 同时明显升高，结合既往文献报道，可知猪苓多糖，尤其是高剂量猪苓多糖可促进巨噬细胞由M2 亚型转换M1 亚型，起保护机体作用。随后采用流式细胞术检测了猪苓多糖干预细胞模型后的M1/M2 特异性的膜分子蛋白指标，可见M2 特异性指标CD206 表达率降低，而CD16/32、CD40 等M1 特异性指标反而升高，提示猪苓多糖可活化巨噬细胞由M2 亚型逆转为M1 亚型，体现了人体免疫动态平衡的可控性，同时与机体免疫调节动态变化的连续过程相切合。结合qRT-PCR 检测结果，发现猪苓多糖可以增加IL-1β，TNF-α 等相应炎症因子水平，并提高M1 膜表面分子CD16/32、CD40 表达量，进一步验证了猪苓多糖通过TLR4 途径活化巨噬细胞的同时，可能通过过活化CD14 信号通路起作用。

综上所述，猪苓多糖可有效活化巨噬细胞，起机体免疫调节，抗肿瘤作用。此外，猪苓多糖在抗热休克蛋白过程中可增加抑制性细胞因子IL-10 的分泌而起减轻炎症的作用，除外TLR4 途径及CD14 信号通路，猪苓多糖是否可通过影响IL-10 相关通路来活化巨噬细胞，尚待后续实验进一步验证。

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