肿瘤相关微淋巴管内皮细胞的研究进展

郑玉平，陈奎生*

(1.郑州大学第一附属医院 病理科，河南 郑州 450052；2.河南省肿瘤病理重点实验室，河南 郑州 450052)

肿瘤相关微淋巴管内皮细胞的研究进展

郑玉平1,2，陈奎生1,2*

(1.郑州大学第一附属医院 病理科，河南 郑州 450052；2.河南省肿瘤病理重点实验室，河南 郑州 450052)

摘要：淋巴道转移是恶性肿瘤转移的重要途径之一，而肿瘤相关微淋巴管内皮细胞是肿瘤发生淋巴道转移的重要界面。关于肿瘤相关微淋巴管内皮细胞分子生物学及分离技术的研究将为进一步探索恶性肿瘤的浸润转移提供更好地平台，同时也为临床上肿瘤转移的预防及治疗提供良好的指南。

关键词：肿瘤；淋巴管内皮细胞；标记分子；调控因子；分离

肿瘤相关微淋巴管内皮细胞是位于肿瘤组织及周边组织淋巴管腔面的一层单层扁平内皮细胞，是肿瘤淋巴管的主要构成单元。肿瘤组织内的新生淋巴管与正常淋巴管相比管壁较薄，内皮细胞连接疏松且基膜不完整，是肿瘤细胞侵入淋巴管管腔的最佳通道[1]。

近十几年来，关于肿瘤相关微淋巴管内皮细胞的研究层出不穷，尤其在分子生物学方面有了较大进展。笔者认为关于淋巴管内皮细胞分子生物学的研究意义重大，一方面，不断发现的特异性标记分子及调控因子为肿瘤的转移提供了更有效的依据；另一方面，从分子水平探讨肿瘤细胞与其相关微淋巴管内皮细胞之间的相互作用，为深刻揭示肿瘤转移的机制提供了更有效的科学依据，同时也能为临床早期阻断淋巴道转移提供了新思路和新方法。现就近几年来国内外肿瘤相关淋巴管内皮细胞的研究进展作一综述。

1肿瘤相关淋巴管内皮细胞的分子标记物

淋巴管系统作为人体除血管系统以外的第二套循环系统，由于长期以来缺乏特异性识别新生淋巴管的标志物，使得对肿瘤淋巴管的研究相对滞后于血管。但近十年来，随着对淋巴系统研究的不断深入，越来越多的淋巴管内皮细胞的分子标记物被发现，主要有：血管内皮生长因子受体-3(vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3)、淋巴管内皮透明质酸受体-1(lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1，LYVE-l)、肾小球足细胞表面蛋白(podoplanin)、抗podoplanin单克隆抗体(D2-40)、podoplanin相关同源基因-1(prospero-related hemeobox gene-1, Prox-1)、桥粒相关转膜糖蛋白(Desmoplakin)、以及血小板内皮细胞黏附分子CD31、唾液酸黏蛋白CD34及5’-核苷酸酶-碱性磷酸酶等[2-3]。这些标志物都具有潜在特异性区分淋巴内皮细胞的能力，但是目前还没有发现一种可以专一的表达于淋巴管内皮细胞表面的标记分子，因此用多种标志物分子共同鉴定肿瘤相关微淋巴管内皮细胞，被较多学者认可，并取得了满意的效果[4]。

1.1　VEGFR-3

VEGFR-3是第一个被发现的淋巴管内皮标记物，为VEGF酪氨酸激酶受体家族成员，是目前研究较多的淋巴管内皮细胞标记物，主要表达于成年组织淋巴管内皮细胞以及胚胎时期的血管内皮细胞[5]。 VEGFR-3的配体为淋巴管内皮相对特异性生长因子VEGF-C和VEGF-D。 VEGFR-3与VEGF-C、VEGF-D的结合，能够激发淋巴管内皮细胞的增殖与迁移，促进淋巴管的新生；VEGF-C、VEGF-D这些淋巴管生成因子主要在恶性肿瘤细胞、炎症或肿瘤浸润细胞及基质细胞等表达[6]。在某些病理状态下,VEGFR-3也能够被激活而发挥促血管生成活性，并且VEGFR-3在肿瘤血管内皮细胞有表达,所以使用抗VEGFR-3抗体不能很好区分血管和淋巴管,故VEGFR-3并不被认为是淋巴管的特异性标志物。

1.2　LYVE-l

LYVE-1是淋巴管内皮细胞表面的透明质酸( hyaluronan,HA)的受体，是有322个氨基酸残基的膜蛋白，其作用是从血液中摄取透明质酸酶并转运至淋巴液，主要表达于成体淋巴管内皮细胞，在肝窦内皮细胞也有表达，但在血管内皮细胞一般无表达[7]，是非常具有特异性的微淋巴管标记物，因此被认为是癌组织进行淋巴转移的特异性标记物。HA在淋巴系统内的代谢可促进肿瘤细胞及白细胞的迁移，因此作为淋巴管内皮特异性透明质酸HA的受体，LYVE-1与HA在相互作用中可能发挥着重要作用。另外，LYVE-1与玻璃酸受体CD44无论是在结构上还是在功能上都具有较高的同源性，研究表明[8]，LYVE-1、CD44 以及VEGFR-3在胃癌中的表达水平明显提高，尤其是在有浸润转移及淋巴结转移的病例中。

1.3　Podoplanin

Podoplanin是肾小球足突细胞膜表面的整合膜蛋白，与维持肾小球通透性以及足状突细胞突起的形态有关，在淋巴管系统的生成过程中也起着决定性的作用，可以促进内皮细胞迁移、黏附和小管形成。Podoplanin主要表达于淋巴管内皮细胞，在淋巴管瘤和具有淋巴分化的血管肉瘤中也有表达，主要是表达于小的淋巴管，而在具有平滑肌细胞的大淋巴管和淋巴导管上不表达[9]。目前，除 Kriehu 等[10]发现其在皮肤某些血管内皮细胞表达外，尚未见Podoplanin 表达于其他组织中微血管的报道。以Podoplanin来标记淋巴管内皮细胞，其特异性和敏感性均较高，是比较理想的微淋巴管标记物。袁世发等[11]的研究表明，Podoplanin在肿瘤内淋巴管和肿瘤细胞都有表达,提示我们一个肿瘤治疗新靶点,即用抗Podoplanin抗体不仅可以杀死顽固的肿瘤起始细胞防止复发,也可以阻断肿瘤内淋巴管生成减少瘤细胞转移,达到一箭双雕的效果。

1.4　D2-40

D2 -40，即抗podoplanin 单克隆抗体，是一种IgG抗体，可以特异性的与M2A癌胚抗原结合。D2-40可以通过识别由淋巴管内皮细胞表达的糖蛋白M2A中的一个固定抗原表位而与之特异性结合，从而标记淋巴管内皮细胞，并且不与血管内皮反应[12]，它主要表达在淋巴管内皮、胎儿生殖母细胞和某些生殖细胞的肿瘤细胞珠的细胞膜上。FukunagaM[13]等将人正常组织(包括胃、结肠、皮肤和软组织)的淋巴管、卡波西肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤进行免疫组化染色发现D2-40均表达阳性,而在血管瘤、血管球瘤、血管脂瘤、血管外皮细胞瘤或者血管内皮瘤中却未检测到。D2-40是一种高选择性淋巴管内皮标志物，已被证实其在多种恶性肿瘤淋巴管浸润的研究中极具价值。

1.5　Prox-1

Prox-1，即果蝇prospero同源异形盒蛋白1，是果蝇的同源异型盒基因prospero在哺乳动物中的同源框基因转录因子。人类Prox-1基因位于染色体lq32.2-lq32.3,长度约为40kb,编码分子质量为83 kD的Prox-1蛋白，转录因子Prox-1对淋巴管形成起决定作用,在淋巴管发育过程中是必需的,决定了淋巴管内皮细胞表型,是内皮细胞向淋巴管分化的主要调节因子。在内皮细胞中,它特异性地表达于胚胎淋巴管以及成人正常和肿瘤组织内的淋巴管，在多种组织的非内皮细胞如晶状体、心脏、肝脏、胰腺和神经细胞等也有表达，因此Prox-1可以用于区分血管和淋巴管，并且具有较好的特异性和灵敏度，其特异性高于VEGFR-3。Prox-1在肿瘤形成及转移过程中,Prox-1也可刺激新的淋巴管形成,促进肿瘤淋巴结转移。Dadras等[14]报道，Prox-1在介导一些肿瘤(如Kaposi's肉瘤)的侵袭性行为中起关键作用。因此一些学者认为Prox-1可以作为肿瘤治疗的靶基因。因为Prox-1表达在细胞核，所以它并不能成为研究淋巴管理想的标志物。但是Prox-1作为一种淋巴内皮的核表达标志物与其他膜型内皮标志物联合作免疫组织化学(荧光)双(多) 重染色可为肿瘤的淋巴管生成与肿瘤转移关系研究带来突破。

1.6　Desmoplakin

Desmoplakin即桥粒相关转膜糖蛋白，是表达于细胞间连接处的桥粒黏附蛋白，参与细胞-细胞之间的黏附。Desmoplakin选择性的表达在毛细淋巴管,而血管及大的淋巴管表达阴性，可以有效地区分毛细淋巴管与血管，是比较理想的淋巴管内皮细胞标记分子。而Fedele C等[15]的研究表明，Desmoplakin不是淋巴管特异性的标记物，并且它的表达具有组织和物种的差异性。所以，关于Desmoplakin还有待进一步探索。

1.7　唾液酸粘蛋白CD34

唾液酸粘蛋白CD34，1984年被美国科学家Civin发现,属于钙黏蛋白家族,是高度糖基化的I型跨膜糖蛋白，属于表面分子涎酸粘蛋白家族成员之一。Fiedler等[16]研究发现，CD34在人体大多数肿瘤相关的微淋巴管内皮细胞均有表达，而在人体正常组织及小鼠的肿瘤相关微淋巴管内皮细胞却为阴性，因此认为CD34可用于鉴别区分人体内的肿瘤相关微淋巴管内皮细胞与其它内皮细胞。胡学庆等[17]通过对人包皮组织的免疫组织化学染色我们发现CD34阳性的血管与CD34阴性但是Podoplanin阳性的淋巴管之间是互相独立的，并通过CD34磁珠阴性分选与CD3l磁珠阳性分选结合的方法，获得了高纯度的淋巴管内皮细胞。

1.8　血小板内皮细胞黏附分子CD31

CD31(platelet endothelial cell adhesion Molecule-1，PECAM-1，又称cluster of differentiation，CD31)，在血管和淋巴管内皮细胞均有表达，参与介导肿瘤发生和血管生成，可作为内皮细胞特异标记物。最新研究显示CD31参与淋巴管内皮细胞的增殖、迁移和管样结构形成等淋巴管新生过程。

1.9　5’-核苷酸酶-碱性磷酸酶

5’-核苷酸酶-碱性磷酸酶是细胞外基质的受体,可以与层黏连蛋白及纤维黏连蛋白相互作用参与细胞的迁移。酶组织化学5’-核苷酸酶-碱性磷酸酶(5’-Nase-ALPase)双重染色法可以特异性的标记淋巴管，表现为血管呈蓝染厚壁管腔,而淋巴管及毛细淋巴管则呈棕色或深棕色薄壁管腔,并有较多皱褶。但是酶组织化学染色很容易受实验条件的影响,其中某一环节的改变都会对结果产生很大的影响。

2肿瘤相关淋巴管内皮细胞的调控因子

淋巴管内皮细胞的发育和增殖除依赖于内皮细胞的生物学特性外，还取决于局部微环境的趋化因子、生长因子的作用。在已知报道的诸多因子中，其中一些可以促进淋巴管内皮细胞的生长，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和内皮素-1 (endothelin -1，ET-1)等；也有一些因子淋巴管内皮细胞的增殖具有明显的抑制作用，并可促进细胞凋亡，从而抑制淋巴管的生成，如内皮抑素(endostatin)、血小板因子-4(platelet factor-4，PF-4)和干扰素-α(interferon-α，IFN-α)等。

2.1　VEGF家族

VEGF家族是目前公认的主要的淋巴管生长因子，与微淋巴管形成密切相关。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及血小板生长因子(placenta growth factor，PIGF)，它们具有相似的氨基酸序列，但各自的调节机制、表达模式以及结合的受体却有很大不同。

VEGF-C和VEGF-D为目前公认的主要淋巴管生成因子，都是二聚体的糖蛋白，拥有8个完全保守、相隔排列、以二硫键维持二聚体的三维空间的半胱氨酸残基。VEGF-C和VEGF-D通过VEGFR-3介导的通路可以导致淋巴管内皮细胞增殖、分化等一系列生物学行为的发生，在诱导肿瘤细胞的增殖及淋巴管生成进而加速肿瘤进展的过程中起着关键作用。

VEGF-C是第一个被发现的与淋巴管生成有关的分子，基因定位于染色体4q34,编码蛋白含419个氨基酸残基,相对分子质量为46.9×103。VEGF-C在许多正常组织都有表达，包括：心肌、骨骼肌、肺脏、肾脏等。VEGF-C通过VEGFR-3的介导作用引起肌动蛋白重组和构型改变，可激发淋巴管内皮细胞增殖和迁移，从而促进淋巴管新生，并且还可以促进肿瘤血管生成。Hirakawa 等[18]通过建立大鼠肿瘤模型，发现 VEGF-C在肿瘤发生转移之前即可促进前哨淋巴结淋巴管网的生成，进而通过前哨淋巴结加速肿瘤细胞的远处转移，另外VEGF-C过表达可提高肿瘤细胞侵袭性。

VEGF-D也称c-fos介导的生长因子(c-fos-induced growth factor，FIGF)，VEGF-D基因定位于Xp22.31，长50Kb,有7个外显子和6个内含子，它与VEGF-C有61%的序列相同。研究发现 VEGF-D可在成人的心脏、肺脏、骨骼肌、结肠和小肠中大量表达。VEGF-D与VEGF-C不仅结构相似，而且功能相似，激活相同受体，二者被认为在淋巴管生成过程中有协同作用。

2.2　碱性成纤维细胞生长因子bFGF

bFGF属于成纤维细胞生长因子家族(FGFs),是第一个被确定的血管形成促进因子,基因位于染色体4q26-27。bFGF共有18, 22, 22. 5, 24和34 kD五种亚型，其中分布最广、含量最多的是18kD的bFGF。bFGF生物学活性的发挥主要通过细胞膜上高亲和力的受体(FGFR)和低亲和力的受体硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)介导。 bFGF诱导的信号转导途径可以促进细胞的分裂增殖,参与血管及淋巴管新生、胚胎发育、骨骼形成和伤口愈合等生理过程。bFGF在体外能使内皮细胞重排为管状结构,组装成毛细淋巴管,并刺激平滑肌细胞和周围细胞的增殖,这些细胞都同新淋巴管的生长有关。bFGF是体外培养淋巴管内皮细胞最强的再生刺激因子,它对细胞增殖、游走以及蛋白酶生成等重要的再生过程均有很强的促进作用。目前的研究还表明，bFGF过度表达与肿瘤发生、发展及预后都有密切关系。

2.3　ET-1

ET-l是由血管内皮细胞产生的一种生物活性肽，含有21个氨基酸的多肽物质。最先发现的ET-1是由血管内皮细胞所分泌，具有很强的缩血管作用。另外，肿瘤细胞也能分泌ET-1，是一种具有自分泌与旁分泌功能的促细胞生长因子，可以促进细胞有丝分裂，参与细胞生长代谢和细胞DNA合成，对原始基因表达和细胞增殖都有一定影响。ET-1作用于血管内皮细胞以及淋巴管内皮细胞，可以刺激血管和淋巴管的生长，还可以促进肿瘤细胞的增殖，从而促进肿瘤的侵袭与转移。王莹等[19]研究发现，在喉癌组织中ET-1过表达可能通过诱导VEGF-C表达上调促进喉癌淋巴管生成和淋巴结转移。

2.4　内皮抑素

内皮抑素是O’Reilly等首先从培养的鼠内皮细胞瘤上清液中发现的血管生成抑制因子，是胶原蛋白X、VII的降解产物，分子量为20kD。内皮抑素在体外能够强烈抑制淋巴管内皮细胞的增殖和游走并明显地抑制肿瘤的生长和转移，还可诱导内皮细胞调亡。很多体外实验证实，endostatin对淋巴管内皮细胞增殖的抑制作用具有明显的剂量依赖性。endostatin可降低内皮细胞内抗凋亡蛋白Bel-2和Bel-XL的表达，引起内皮细胞凋亡；endostatin可以抑制淋巴管生长因子VEGF-C、VEGF-D及bFGF，阻断肿瘤淋巴管生成及淋巴转移；endostatin能与bFGF和vEGF竞争内皮细胞表面的硫酸肝素粘蛋白类，从而阻断有丝分裂的信号转导通路，抑制内皮细胞增殖。

2.5　PF-4

PF-4属于趋化性细胞因子CXC亚家族,是血小板聚集时由α-颗粒释放的肽类物质，成熟的PF-4有70个氨基酸组成，分子量为7.8kD。PF-4是一种多功能蛋白,可抑制造血、干扰血小板的凝固作用、促进炎症反应，抑制血管的生成[20],同时还抑制淋巴管内皮的增殖和游走。PF-4对血管产生抑制作用的机理是通过阻断FGF-2二聚体与FGF受体的结合而形成FGF-2复合物,从而抑制血管内皮细胞自发游走和调节FGF的促有丝分裂活性;同时也阻断了EGF与细胞表面的硫酸软骨素的反应,抑制了VEGF的促有丝分裂活性,从而抑制内皮细胞的增殖和游走。鉴于血管和淋巴管在结构和功能上较大的相似性,谢方民等[21]推断PF-4对淋巴管内皮细胞的抑制作用可能与血管的相同，并且其研究显示PF-4对淋巴管内皮细胞的增殖和游走的抑制作用具有剂量依赖性,随着浓度的增加其抑制作用逐渐增强。

2.6　IFN-α

干扰素是人体免疫系统在机体感染病毒后产生的重要细胞因子，由单核细胞和淋巴细胞产生，是一类分泌性蛋白，在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据产生干扰素细胞来源不同、理化性质和生物学活性的差异，可分为IFN-α、IFN-β和IFN-γ，其中IFN-α主要由白细胞及类淋巴细胞产生，其分子由166或165个氨基酸组成，无糖基，分子量约19kDa左右，分子内含有4个二硫键。IFN-α能抑制血管生成的重要生长因子VEGF-C的释放，阻断VEGF-C/VEGFR-3的信号传导，从而抑制实体瘤周围淋巴管的生成。另外，IFN-α能与细胞表面的特异性受体结合来调节免疫应答,能诱导调节细胞活性的蛋白质的合成,抑制淋巴管内皮细胞的增生和迁移。刘超等[22]的实验证实了IFN-α均具有促进细胞凋亡的作用,对淋巴管内皮细胞的生长和增殖具有明显的抑制作用，并在干扰素活体实验中,进一步证实IFN-α可以抑制淋巴管的生长愈合。

3肿瘤相关淋巴管内皮细胞的分离

1984年，Johnston和Walker[23]首次成功分离并培养出狗胸导管内皮，并观察了其形态。近几十年来，随着肿瘤浸润转移机制逐渐成为热点，人们对淋巴管内皮细胞的研究越来越多。目前，在已知的报道中，各种组织来源的淋巴管内皮细胞被成功分离，如动物的胸导管和肠系膜淋巴管、人的真皮、前列腺癌、口腔鳞癌、乳腺癌、胃癌等。

既往，关于淋巴管内皮细胞的分离方法主要有酶消化法和植块培养法，具体选择何种方法进行培养主要取决于标本来源。对于胸导管这类大淋巴管可以选择管内酶消化法，取材方便，细胞消化彻底。但常用胶原酶和胰蛋白酶联合消化，对细胞损伤较大。对于肠系膜淋巴管等较细小的淋巴管的可选择植块培养法，虽然该法较酶消化法简便、经济，不须使用昂贵的胶原酶和对细胞有毒性的胰蛋白酶，但标本取材困难，植块能否牢固贴壁是细胞培养成功与否的关键 。以上两种方法，都适用于管径较大的淋巴管，对于组织来源的微淋巴管却无法实施，并且都会不可避免地造成杂细胞的污染。随着免疫磁珠的开发利用，使得对微淋巴管内皮细胞的分选成为可能。

免疫磁珠法分离技术是一种免疫学检测和分离技术，它是以高均一性的磁性微球为固相支持物，免疫配基(如抗体，抗原等)通过功能基团结合到磁性载体上形成免疫磁性微球，利用特异性的免疫学反应，在磁力作用下，发生力学移动，从混合溶液中分离检测靶物质。免疫磁珠法分离细胞的技术目前已经比较成熟，采用此法成功分离细胞的报道也频频出现。但是，免疫磁珠法分离细胞步骤繁琐，且耗材较贵，蒋朝华等[24]发现，使用流式细胞仪(Flow Cytometer，FCM)分选细胞，能够高效率和高纯度地获得人真皮来源的LECs，同时在操作上也更为简洁方便，因此也得到更多学者的认可。淋巴管内皮细胞的体外分离是研究其细胞生物学及分子生物学的实验基础，更好的发展及掌握此项技术将为人们深入研究提供重要的实验手段和丰富的细胞来源，也为进一步探究恶性肿瘤的淋巴道转移机制提供更好的平台 。

4展望

综上所述，肿瘤相关微淋巴管内皮细胞是肿瘤发生淋巴道转移的重要界面，随着肿瘤相关微淋巴管内皮细胞分离技术的不断创新和提高，淋巴管内皮细胞特异性标记物及淋巴管生长的调控因子不断被发现发现，这为人们探索肿瘤淋巴道转移机制提供了更好的平台，同时也为临床控制肿瘤淋巴管生成及淋巴道转移提供了一个新的靶点。目前的研究发现，在肿瘤发生浸润转移的这个微环境中，肿瘤细胞与其相关微淋巴管内皮细胞间的相互作用是肿瘤细胞淋巴道播散的关键步骤，更加深刻的探讨肿瘤相关微淋巴管内皮细胞与肿瘤细胞之间出现何种生物学行为及如何发生相互作用，对于研究肿瘤淋巴道转移机制将会有突破性的意义，对于早期控制肿瘤的浸润转移与扩散，提高患者术后生存率也有较大的意义。

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[责任编辑李麦产]

The advances of tumor-associated microlymphatic endothelial cells

ZHENG Yuping, CHEN Kuisheng*

(1.DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450052,China;2.HenanKeyLaboratoryforTumorPathology,Zhengzhou,Henan450052,China)

Abstract:Lymphatic metastasis is one of the most important metastasis approaches of malignant tumor. The tumor-associated lymphatic endothelial cell is the important interface of tumor metastasis. The research on molecular biology and separation technology of tumor-associated microlymphatic endothelial cells will not only provide a better platform for the deep exploration of malignant tumor invasion and metastasis, but also provide a good guide for the prevention and treatment of tumor metastasis.

Key words:neoplasms; lymphatic endothelial cells; molecular marker; control factor; separation

*通讯作者：陈奎生(1964—)，男，河南长葛市人，博士，教授，从事恶性肿瘤的浸润转移机制及阻断的研究工作。

作者简介：郑玉平(1987—)，女，山东德州市人，硕士研究生，从事恶性肿瘤的浸润转移机制及阻断的研究工作。

基金项目：国家自然科学基金项目(81272370)。

收稿日期：2015-04-21

文章编号：1672-7606(2015)03-0220-06

中图分类号：R733

文献标识码：A