功劳木的化学成分及其体外对P-糖蛋白转运的影响

郭敬功，刘　静，李沙沙，沈　姗，王江英，王天晓，丛　悦*

(1. 河南大学 生命科学学院，河南 开封 475004；2. 河南大学 药物研究所，河南 开封 475004)

功劳木的化学成分及其体外对P-糖蛋白转运的影响

郭敬功1，刘静2，李沙沙2，沈姗2，王江英2，王天晓2，丛悦2*

(1. 河南大学 生命科学学院，河南 开封 475004；2. 河南大学 药物研究所，河南 开封 475004)

摘要：目的研究功劳木的化学成分，评价其体外对P-糖蛋白转运的影响。方法功劳木用体积分数为70%乙醇提取，得到的浸膏经硅胶干柱色谱分成8份，其中第3~5份和第8份经反复硅胶柱色谱分离得到3个化合物，利用理化性质和波谱数据鉴定了它们的化学结构，并检测3个化合物对耐药细胞株K562/ADM细胞内罗丹明(rhodamine123，Rh123)蓄积的影响。结果显示3个化合物分别为：1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S,3S, 4R,8E)-2- [(2’R)-2’-hydroxytetra cosenoilamino]- 8-octadec-ene-1, 3, 4-triol (1)、erthro-syringoyl glycerol 4-O-β-D-glucoside (2)、葡萄糖(3)。结论化合物1~3为首次从本属植物中分离得到，化合物1和2明显增加耐药细胞株K562/ADM细胞内罗丹明(rhodamine123，Rh123)蓄积量，表现出抑制P-糖蛋白转运功能的活性。

关键词：功劳木；化学成分；糖蛋白转运；耐药性

功劳木为小檗科植物阔叶十大功劳Mahonia bealaei(Fort)Carr.的茎，十大功劳属植物全世界约有100种，中国约占35种，该属大多数植物是分布国的传统药或民间药，具有清凉、解毒、滋阴、强壮之功效，民间常用于治疗感冒、清热、解毒、消炎镇痛、利胆止泻等疾病[1-2]。现代药理研究[3-4]表明，该属植物所含的生物碱具有很好的逆转肿瘤多药耐药作用和逆转大肠杆菌耐药性作用。我们课题组对功劳木的化学成分进行了系统研究并进行了肿瘤多药耐药的筛选[5-7]，发现很多非生物碱成分逆转肿瘤多药耐药作用也很显著。在此基础之上，进一步研究功劳木的化学成分，并采用高内涵活细胞成像系统检测化学成分对耐药细胞株K562/ADM内荧光染料罗丹明123(Rh123)蓄积量的影响[8-10]，探讨功劳木化学成分对耐药细胞株K562/ADM膜表面P-糖蛋白(P-gp)转运功能的影响，为以后深入筛选逆转肿瘤细胞多药耐药的活性物质提供重要的参考价值。

1材料与方法

1.1　实验仪器与药剂

Bruker AVANCE 400M型核磁共振波谱仪；Bruker Esquire LC液相色谱-质谱联用仪；JJ-CJ-2FD超净化工作台(吴江市净化设备总厂) ；N-1001旋转蒸发仪(日本Eyela公司)；8000DH型二氧化碳细胞培养箱(美国Thermo公司) ；Arrary Scan VTIHCS 600型高内涵活细胞成像系统(美国Thermo公司)。

硅胶G(粒度200～300目，青岛海洋化工厂)；薄层层析硅胶G(10～40 μm，青岛海洋化工厂)；罗丹明123(Rh123, 美国Sigma公司)；Hoechst 33342(美国Sigma公司)；Sephadex LH-20(GE Healthcare) ； 维拉帕米(上海禾丰制药有限公司)。功劳木购自亳州药材市场，由河南大学药学院丛悦副教授鉴定为小檗科阔叶十大功劳Mahoniabealaei(Fort.)Carr.的茎，植物标本保存于河南大学药物研究所。K562/ADM(人红白血病阿霉素耐药细胞株) 购于中国医学科学院血液病研究所。

1.2　实验方法

1.2.1功劳木化学成分的提取分离功劳木干燥饮片7.0 kg，35 L 体积分数为 70%乙醇加热提取，提取5次，每次2.5 h，合并提取液，减压浓缩回收乙醇，得到提取物911 g，提取物经硅胶干柱色谱分离，用氯仿-甲醇-水(8∶2∶0.2)洗脱，均分8份，每份均用氯仿-甲醇(3∶2→纯甲醇)梯度洗脱，回收溶剂浓缩。合并第3、4、5份样品经反复硅胶柱层析，氯仿-甲醇(200∶1→纯甲醇)梯度洗脱，第185～188馏分经反复硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(4∶6∶1)洗脱得化合物1 (15 mg)。第8份样品经Sephadex LH-2柱层析和反复硅胶柱层析，洗脱剂为氯仿-甲醇-水-冰乙酸(4∶1∶0.1∶ 0.1)，得到化合物2(22 mg)和化合物3(17 mg)。

1.2.2K562/ADM细胞株的培养见文献[7]。

1.2.3逆转肿瘤多药耐药活性成分的筛选方法见文献[7]。

2结果与分析

2.1　功劳木乙醇提取物的结构鉴定

化合物1 白色粉末, Molish反应阳性, ESI-MS m/z：876.5[M+35Cl]-, 878.5 [M+37Cl]-, 结合1H-NMR和13C-NMR数据推断分子式为C48H91NO10, 参照文献[6]报道的波谱数据比较，推测该化合物为脑苷脂类成分。根据1H-NMR、13C-NMR、HMQC和HMBC谱将碳氢进行了归属。1H-NMR (DMSO, 400 MHz) δ: 7.59(1H, d, J=9.2 Hz, NH), 5.34 (1H, m, H-8), 5.31 (1H, m, H-9), 5.28 (2H, m, H-15’, 16’), 4.05 (1H, m, H-2), 3.61 (1H, m, H-1), 3.80 (1H, m, H-1), 3.33 (1H, m, H-4), 3.82 (1H, m, H-2’), 3.34 (1H, m, H-3), 4.12(1H, d, J=8.0 Hz, Glc-1), 1.57(2H, m, H-3’, 5), 1.50(2H, m, H-6), 1.47(2H, m, H-3’, 5), 1.96 (8H, m, H-7, 10, 14’, 17’), 1.22~1.40 (46H, m, H-11~17, 4’~13’, 18’~23’), 0.83 (6H, t, J=6.8 Hz, CH3-24’, 18)。13C-NMR (DMSO, 100 MHz) δ:174.3(C-1’), 130.8 (C-8), 129.9 (C-9), 129.8 (C-15’,16’), 103.9 (Glc-1’), 77.3 (Glc-5’), 76.9 (Glc-3’), 73.9 (C-3, Glc-2’),71.4 (C-2’), 71.0 (Glc-4’), 71.4 (C-4), 70.3 (C-1), 61.4 (Glc-6’), 50.3 (C-2), 34.9 (C-10), 34.8 (C-3’), 31.8 (C-5, 7, 16, 22’), 27.0 (C-14’), 27.1(C-17’), 26.1(C-6), 24.9 (C-4’), 22.6(C-17, 23’), 29.0~29.6 (C-11~15, 5’ ~13’, 18’ ~21’), 14.3 (C-18, 24’)。

采用甲醇分解反应[11-12]制备化合物1结构上的脂肪链和碱基链，进行ESI-MS分析，结果显示脂肪酸甲酯(m/z)：419.1 [M+Na]+，碱基链(m/z)：316.2 [M+H]+，以上数据结果与文献[13]基本一致，确定化合物1为1-O-(β-D-glucopyranosyl)-(2S, 3S, 4R, 8E)-2-[(2’R)-2’-hydroxytetracosenoilamino]-8-octadecene-1, 3, 4-triol。

化合物2白色粉末, Molish反应阳性, ESI-MS m/z: 429.2 [ M+Na ]+, 1H-NMR (DMSO, 400 MHz) δ: 6.65(2H, s, H-2, 6), 4.85(1H, d, J=7.2 Hz, Glc-1), 4.52(1H, d, J=5.6 Hz, H-7)，3.74(6H, s, 2×OCH3), 3.48 (1H, m, H-8), 3.60 (1H, dd, J=4.0, 12.0 Hz, Glc-6), 3.45 (1H, m, Glc-6), 3.39(1H, m, H-9)，3.10~3.23(4H, m, Glc-5, Glc-2, Glc-4, H-9), 3.03(1H, m, Glc-3)。13CNMR (DMSO, 100 MHz) δ: 152.5 (C-3, 5), 139.8 (C-4), 133.7(C-1), 103.3(Glc-1), 105.4(C-2, 6), 73.0 (C-7), 76.0 (C-8), 63.1 (C-9), 56.8 (2×OCH3), 61.4 (Glc-6), 70.4 (Glc-4), 74.6(Glc-2), 77.6 (Glc-5), 76.9(Glc-3)。经与文献[14]数据对照基本一致。因此, 鉴定化合物2为erthro-syringoylglycerol 4-O-β-D-glucosidea。

化合物3 白色粉末, ESI-MS m/z：181.2[M+H]+,1H-NMR (D2O, 400 MHz) δ: 5.25(1H, d, J=3.6 Hz, α-Glc-1), 4.66(1H, d, J=7.6 Hz, β-Glc-1);13C-NMR (D2O, 100 MHz) δ: 95.9(β-Glc-1), 74.1(β-Glc-2), 75.7(β-Glc-3), 69.6(β-Glc-4), 75.9(β-Glc-5), 60.7(β-Glc-6), 92.1(α-Glc-1), 71.4(α-Glc-2), 72.8(α- Glc-3), 69.6(α-Glc-4), δ71.5(α-Glc-5), 60.6 (α-Glc-6)。数据结果与文献[15-16]一致，表明化合物3为α-葡萄糖和β-葡萄糖两种构型的混合物。

2.2　3种化合物体外逆转肿瘤多药耐药活性

应用高内涵方法[7]检测化合物1～3对耐药细胞株K562/ADM内Rh123蓄积量的影响。化合物1和2给药浓度为10 μmol/L时，Rh123荧光强度增长率分别为24.01%、5.17%；给药浓度为50 μmol/L时，Rh123荧光强度增长率分别为39.32%、8.63%。化合物3与空白组比较荧光强度无变化。阳性对照维拉帕米给药浓度为10 和50 μmol/L时，Rh123荧光强度增长率分别为3.24%、 34.20%。结果表明化合物1和2都影响细胞膜上P-糖蛋白的转运功能，使耐药细胞株K562/ADM内Rh123蓄积量发生改变，其中化合物1的活性最强。

3讨论

我们采用柱色谱法，从功劳木的乙醇提取物中分离得到3个化合物，1-O-(β-D- glucopyranosyl)-(2S,3S,4R,8E)-2-[(2’R)-2’-hydroxytetracosenoilamino]-8-octadecene-1, 3, 4-triol (1)、erthro-syringoyl glycerol 4-O-β-D-glucoside (2)、葡萄糖(3)均为首次从该属植物中分离得到。并采用高内涵活细胞成像系统检测分析了这3个成分对K562/ADM细胞内RH123蓄积的变化，以检测其对细胞膜上P-gp功能的影响。由于P-gp在许多组织有分布，是一种ATP依赖性膜转运体，作为药物转运子，其作用类似于排出泵，可将药物从细胞内外排而使胞内药物浓度降低，从而降低药效，所以P-gp参与肿瘤细胞多药耐药的发生。实验结果显示：化合物1显著抑制耐药细胞株P-gp转运功能。化合物1属于大豆脑苷类成分，结合前期研究结果[7], 发现这类成分具有一定潜在的逆转肿瘤细胞多药耐药性的活性特点，为日后深入研究逆转肿瘤多药耐药的药效物质筛选，提供重要的实验依据。

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[责任编辑李武营]

Chemical constituents from the stem of mahonia bealei (Fort.) carr on p-glycoprotein transport

GUO Jinggong1, LIU Jing2, LI Shasha2, SHEN Shan2, WANG Jiangying2, WANG Tianxiao2, CONG Yue2

(1.HenanUniversityInstituteofPharmacy,Henan,Kaifeng475004,China；2.SchoolofLifeScience,Henan,Kaifeng475004,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of chemical constituents from the stem of Mahonia bealei (Fort.) Carr on P-glycoprotein transport. MethodsMahonia bealei (Fort.) Carr was extracted by 70% alcohol and the extract were separated by dry column chromatography over silica gel into 8 portions. Portions 3-5 and portion 8 were separated and purified by repeated column chromatography on silica gel to get three compounds. Each compound was characterized by spectroscopic and physical data. The effects of three compounds on Rhodamine123 accumulation in K562/ADM cells were detected by high content screening analysis. ResultsThree compounds have been purified and identified as 1-O-(β-D-glucopyranosyl) -(2S, 3S, 4R, 8E)-2- [(2’R) -2’-hydroxytetracosenoilamino]-8-octadecene-1,3,4-triol(1), erthro-syringoyl glycerol4-O-β-D-glucoside(2) and glucose(3) respectively. Conclusion Compounds 1~3 were obtained for the first time from the genus Mahonia.Compounds 1 and 2 significantly increased accumulation of Rh123 in K562/ADM cells, and showed inhibition of P-glycoprotein transport function.

Key words:Mahonia bealei; chemical constituents; structure identification; multidrug resistance

*通讯作者：丛悦(1978-)，女，辽宁辽阳市人，博士，副教授，从事中药化学与质量标准研究工作。

作者简介：郭敬功(1982-)，男，山东菏泽市人，实验师，从事细胞信号转导的研究工作。

收稿日期：2015-05-12

文章编号：1672-7606(2015)03-0163-03

中图分类号：TQ460.72

文献标识码：A