旋毛虫肌幼虫囊包标本HE染色制作方法

都景芳，邱　娜，蔡　欢，闫钰鑫，樊　航，张　澎，娄源航，王国英*

(1. 河南大学 医学院，河南 开封 475004;2. 河南大学 民生学院，河南 开封 475004)

旋毛虫肌幼虫囊包标本HE染色制作方法

都景芳1，邱娜1，蔡欢2，闫钰鑫2，樊航1，张澎1，娄源航2，王国英1*

(1. 河南大学 医学院，河南 开封 475004;2. 河南大学 民生学院，河南 开封 475004)

摘要：目的 比较4种HE染色方法制作旋毛虫肌幼虫囊包标本的效果。方法HE染色方法1：苏木精染色5 min，伊红染色5 min，分色；HE染色方法2：苏木精染色15 min，伊红染色5 min，分色；HE染色方法3：苏木精染色1h，伊红染色30 min，分色；HE染色方法4：苏木精染色1h，伊红染色1h，分色。 结果HE染色方法4制作的旋毛虫肌幼虫囊包标本, 囊包梭形显著，结构清晰，囊内幼虫特征典型。结论HE染色方法4制作的标本，染色效果好，易于观察。

关键词：旋毛虫；肌幼虫囊包；标本；染色

苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色法，简称HE染色(HE staining)。这种经典的方法一般用于石蜡切片术中切片标本的染色。在寄生虫学实验教学中，旋毛虫(Trichinella spiralis) 肌幼虫囊包永久性标本，常用压片染色法， 使用固绿、卡红、吉氏染液或天狼猩红等染料制作[1-3]。 本研究将HE染色应用于旋毛虫肌幼虫囊包标本制作，并结合具体情况加以改进，得到了较好的染色效果，现将结果报道如下。

1材料与方法

1.1　主要试剂

固定液： 甲醛6 mL、体积分数95%乙醇20 mL、冰醋酸1 mL和蒸馏水40 mL， 混合均匀。Harris苏木精染色液[4]：苏木精1g，硫酸铝钾15 g，无水乙醇10 mL，蒸馏水200 mL。先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5 g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用前滤纸过滤后每100 mL加冰醋酸5 mL。水溶性伊红染色液[4]：伊红0.5 g, 蒸馏水100 mL,先将水溶性伊红加入蒸馏水中，用玻璃棒将伊红搅起泡沫后过滤，每100 mL加冰醋酸1滴。分色液： 体积分数2%的盐酸乙醇。

1.2　标本采集与制片

旋毛虫(Trichinella spiralis)引自河南省疾病预防控制中心。15 只昆明小鼠， 体质量18～22 g， 雌性，购自郑州大学实验动物中心。每鼠感染200 条肌幼虫， 感染30 d 后引颈处死， 取膈肌、前肢肌和后肢肌， 压片、镜检。用生理盐水清洗含幼虫的肌肉， 置于4 ℃冰箱2 h， 膈肌剪成约0.5×0.5 cm， 其他部位肌肉剪成小碎块， 夹在两张载玻片之间， 轻轻加压、玻片两端用细线捆扎固定， 制成制片。

1.3　HE染色

1.3.1染色方法1制片置于固定液中24 h，解线后再固定1 h， 流水冲洗5 min， 间隔5 min， 蒸馏水冲洗5 min。固定后的制片置于苏木精染色液中染色5 min，取出后蒸馏水冲洗5 min；体积分数2%盐酸乙醇分色1 min；伊红染色液中染色5 min，蒸馏水冲洗2 min。依次放入50%、70%、80%、95%和100%乙醇中脱水， 各30 min。无水乙醇与二甲苯(比例1 ∶ 1) 混合液中透明30 min， 纯二甲苯30 s。在载玻片上滴2 滴中性树胶， 放入制片， 加盖玻片， 平置标本盒内， 室温阴干。

1.3.2染色方法2苏木精染色液染色15min，伊红染色液染色5 min，其他操作步骤同染色方法1。

1.3.3染色方法3制片置于固定液中24 h，解线后再固定1 h， 流水冲洗5 min， 间隔5 min， 蒸馏水冲洗5 min。固定后的制片置于苏木精染色液中染色1 h，取出后蒸馏水冲洗5 min；体积分数2%盐酸乙醇分色2 min；伊红染色液中染色30 min，蒸馏水冲洗5 min。依次放入体积分数50%、70%、80%、95%乙醇中脱水，各30 min。然后用体积分数2%盐酸乙醇分色30min，再放入100%乙醇中脱水30 min。无水乙醇与二甲苯(比例1 ∶ 1) 混合液中透明30 min， 纯二甲苯30 s。在载玻片上滴2 滴中性树胶， 放入制片， 加盖玻片， 平置标本盒内， 室温阴干。

1.3.4染色方法4苏木精染色液染色1h，2%盐酸乙醇分色2 min；伊红染色液染色1 h，体积分数2%盐酸乙醇分色45 min，其他操作步骤同染色方法3。

2结果

2.1　染色方法1制作的标本

光学显微镜下观察，囊包内含1 条幼虫，与周围肌细胞无明显分界，囊壁结构模糊，内、外层区分不明显， 囊包与周围肌细胞无明显色差，均呈深紫色，不易区分。幼虫淡染， 蜷曲， 能辨认(图1 A)。

2.2　染色方法2制作的标本

光学显微镜下观察， 囊包梭形。囊内呈浅紫色， 肌细胞呈深紫色， 浅于囊内着色， 囊包与周围肌细胞分界模糊。幼虫淡染， 能辨认(图1 B)。

2.3　染色方法3制作的标本

光学显微镜下观察， 囊包形状可辨认，呈梭形，囊包与周围肌细胞能够区分；囊壁结构清晰，内、外层分界明显，囊壁内层呈浅紫红色，幼虫淡染， 能较清晰辨认(图1 C)。

2.4　染色方法4制作的标本

光学显微镜下观察， 囊包呈较宽的梭形，结构清晰，与周围肌纤维分界明显，易于区分。囊壁分两层， 外层较薄， 内层较厚紧裹幼虫， 两层之间间隙明显。内层呈着色均匀的深紫色； 肌细胞呈淡紫色， 着色均匀， 囊包与周围肌细胞色差明显，幼虫淡染， 淡紫色，螺旋状蜷曲， 能清晰辨认(图1 D)。

图1　HE染色方法制作的旋毛虫肌幼虫永久标本(放大倍数10×10)

3讨论

HE染色目的是通过染料使不同的组织染成不同的颜色，从而使组织结构在光学显微镜下能很好显示。苏木精主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色，伊红主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。通过HE染色，正常组织和病变组织的形态结构易于观察[5-7]，是组织学和病理学最常用、最简单的方法。对石蜡切片的要求是薄切。

寄生虫成虫和幼虫的标本制作， 通常采用压片法，压片的厚度远远大于切片厚度，因此，根据旋毛虫肌幼虫囊包标本制作的实际情况，将组织学和病理学制片常用的HE染色法做了较大的改进[8]。本实验HE染色方法1和方法2制作的标本，结果显示，囊包与周围肌细胞无明显分界，囊壁结构模糊，囊包色泽较暗，幼虫不够清晰。可能因为苏木精染色液和伊红染色液的染色时间较短，而压片厚度较厚，未能将囊包的内部结构较好染色，染色时间对囊包的着色深浅有较大影响；伊红染色后没有再分色，囊包周围肌细胞着色较深，导致染色效果不佳，无法较好地观察囊包的形态结构。

本实验HE染色方法3和方法4制作的标本，结果显示，囊内幼虫、囊包、肌细胞色泽对比显著，梭形囊包结构清晰，特征典型。囊壁内外两层结构层次分明，区别明显，可清晰观察。可能原因为，虽然压片厚度较厚，但苏木精染色液和伊红染色液的染色时间较长，使染料将囊包的内部结构较好染色。伊红染色后又进行了一次再分色，使周围肌细胞颜色与囊包有明显差别，比较容易区分、观察。

本实验结果显示， 染色方法4制作的标本效果最佳。该染色法制作的标本能够满足实验教学的要求。

参考文献：

[1] 皮本伟, 牛利娜, 李丹, 等. 旋毛虫肌幼虫囊包染色标本制作方法的改进[J]. 中国病原生物学杂志, 2012, 7(1): 48-49.

[2] 牛利娜, 李丹, 杨丁, 等. 一种快速、简便制作旋毛虫幼虫永久标本的方法[J]. 中国病原生物学杂志, 2011, 6(11): 878-879.

[3] 陈莹， 杨晓燕， 郑焕钦， 等. 三种旋毛虫肌肉期幼虫染色方法的比较研究[J]. 热带医学杂志， 2010， 10(1)： 9-10.

[4] 王伯沄，李玉松，黄高昇，等.病理学技术[M].1版. 北京: 人民卫生出版社，2000：131-133.

[5] 邹仲之主编. 组织学与胚胎学[M]. 7版. 北京: 人民卫生出版社，2008：1-8.

[6] 徐明堂, 何春年, 张秀智.苏木染液的配制及染色方法的改进[J]．临床与实验病理学杂志，2008，24(3)：371-372.

[7] 龚 林，袁 峰，潘贵君. 简便快速的胰腺组织块HE染色法[J]．擸州医学院学报，2010，33 (5)： 555-557.

[8] 蒋杞英，李中华，齐云飞.组织学与胚胎学实验指导[M]. 1版. 北京: 中国科学技术出版社，2004：3-4.

[责任编辑时红]

HE staining methods for making permanent specimen of trichinella spiralis encapsulated larvae

DU Jingfang1, QIU Na1, CAI Huan2, YAN Yuxin2, FAN Hang1, ZHANG Peng1, LOU Yuanhang2, WANG Guoying1*

(1.MedicalCollege，HenanUniversity，Kaifeng,Henan475004，China；2.MinshengCollege，HenanUniversity，Kaifeng,Henan475004，China)

Abstract:ObjectiveA comparative staining effect of four HE staining methods for specimen of Trichinella spiralis encapsulated larvae. MethodsNo.1 The speciemens were stained with hematoxylin staining solution for 5 min and eosin staining solution for 5 min， and faded.No.2 The speciemens were stained with hematoxylin staining solution for 15 min and eosin staining solution for 5 min， and faded.No.3 The speciemens were stained with hematoxylin staining solution for 1h and eosin staining solution for 30 min， and faded.No.4 The speciemens were stained with hematoxylin staining solution for 1h and eosin staining solution for 1h， and faded.ResultsThe results showed that with the HE staining method No.4 ,the specimens showed clear structures and obvious shuttle figure.Conclusion The encapsulated larvae had a representative character, and easy to be observed.

Key words:trichina spiralis; encapsulated larvae; specimen; staining

*通讯作者:王国英(1962-)，女，山西运城市人，高级实验师，从事寄生虫免疫及流行病学的教学及研究工作。

作者简介：都景芳(1963—)，女，实验师，河南巩义市人，从事医学实验及教学工作。

基金项目：河南省教育改革资助项目(2014SJGLX137)。

收稿日期：2015-04-12

文章编号：1672-7606(2015)03-0187-03

中图分类号：R383.1

文献标识码：A