小檗碱减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤及其对Notch1／Hes1信号通路的调控研究

于立明，赵国龙，金振晓，张秋芳，王晓武，高文丽，王 云，段维勋，俞世强

小檗碱减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤及其对Notch1／Hes1信号通路的调控研究

于立明，赵国龙，金振晓，张秋芳，王晓武，高文丽，王 云，段维勋，俞世强

［摘要］：目的 研究小檗碱（BBR）减轻大鼠心肌缺血再灌注（MI／R）损伤的作用及其对心肌Notch1／Hes1信号的调控。方法 100只雄性SD大鼠随机分为五组：假手术组（Sham）、MI／R＋溶剂组（MI／R＋V）、MI／R＋BBR治疗组（MI／R＋BBR）、Sham＋溶剂组（Sham＋V）、Sham＋BBR组。行结扎大鼠冠状动脉左前降支手术造成MI／R模型，心肌缺血30 min，再灌注4 h后检测心肌Notch1受体胞内区（NICD）及Hes1、PTEN、p－Akt／Akt比值和凋亡相关蛋白表达，再灌注6 h后检测心肌细胞凋亡率、梗死面积及氧化应激相关指标，再灌注72 h后检测心功能。结果 缺血再灌注损伤显著下调左心射血分数与左心室短轴缩短率，增加心肌凋亡率、梗死面积、血清乳酸脱氢酶及肌酸肌酶水平，而BBR治疗可显著改善心功能并减轻心肌凋亡及梗死。另外，BBR治疗可显著激活心肌Notch1／Hes1信号通路并调控PTEN／Akt信号，从而下调心肌凋亡信号（均P＜0．01）。结论BBR治疗可显著减轻MI／R损伤后心肌梗死及凋亡水平，改善心功能。同时，BBR治疗可显著上调缺血打击后心肌Notch1／Hes1信号并对PTEN／Akt信号发挥调控作用，下调心肌凋亡信号。

［关键词］：小檗碱；心肌缺血／再灌注损伤；Notch1信号；凋亡；心肌保护

作者单位：710032 西安，第四军医大学西京医院心脏外科［于立明（研究生）、金振晓、王晓武、段维勋、俞世强］；750004银川，宁夏医科大学附属医院心脏外科［赵国龙、高文丽（研究生）、王云］；710004西安，第四医院影像科（张秋芳）

Berberine protects the heart against myocardial ischemia reperfusion injury：role of Notch1／Hes1 signaling pathway

Yu Li－ming，Zhao Guo－long，Jin Zhen－xiao，Zhang Qiu－fang，Wang Xiao－wu，Gao Wen－li，Wang Yun，Duan Wei－xun，Yu Shi－qiang
Fourth Military Medical University，Xi＇an，710032，Shaanxi，China

Corresponding author：Yu Shi－qiang，Email：shiqiangyu210＠126．com

［Abstract］：Objective To explore the ameliorative effect of berberine（BBR）on myocard ial ischemia／reperfusion（MI／R）in⁃jury in rats and its influence on myocardial Notch1／Hes1 signaling pathway．Methods 100 male Sprague－Dawley rats were randomly assigned to 5 groups：Sham，MI／R＋V（vehicle），MI／R＋BBR，Sham＋V and Sham＋BBR，and then exposed to myocardial ischemia／reperfusion（MI／R）surgery．After 4 h of reperfusion，myocardial NICD（Notch1 intracellular domain），Hes1，PTEN，p－Akt／Akt ra⁃tio and apoptotic related protein espressions were measured．After 6 h of reperfusion，myocardial apoptotic index and infarct size were e⁃valuated．The cardiac function were measured 72 h after reperfusion．Results BBR treatment significantly improved the cardiac func⁃tional recovery and reduced myocardial apoptosis．Additionally，BBR treatment also modulated PTEN／Akt signaling by activating Notch1／Hes1 signaling．Conclusion This study showed that BBR protected the heart against MI／R injury by reducing apoptosis possi⁃bly through Notch1／Hes1 signaling pathway．

［Key words］： Berberine；Myocardial ischemia／reperfusion injury；Notch1 signaling；apoptosis；Cardioprotection

缺血性心脏病严重危害人类健康，及时恢复缺血心肌血流灌注是其首要治疗策略，但是缺血期处于可逆损伤的心肌细胞，恢复血液供应后转化为不可逆损伤，诱发心肌缺血／再灌注（myocardial ische⁃mia／reperfusion injury，MI／R）损伤［1－2］。小檗碱（berberine，BBR）是从毛茛科植物黄连（Coptis chinensi）根茎中提取的有效成分，有抗心律失常、抗充血性心力衰竭、降血糖血脂等保护作用［3］。近年来有研究指出小檗碱对心肌缺血性疾病有较好的保护作用［4］，但其具体机制尚不明确。Notch信号通路是一个进化上保守的细胞间信号传导通路，其广泛参与细胞的生长、增殖、分化以及器官的发育等过程，Notch信号通路的活化参与了多种氧化应激和炎症病理过程［5］。本课题前期研究发现，激活Notch1信号发挥心肌保护作用［6－7］，然而Notch信号通路是否参与BBR的心肌保护作用尚未有报道。为此本实验采用大鼠MI／R模型，探讨小檗碱对MI／R损伤的保护作用及其对心肌Notch1／Hes1信号的调控作用。

1 材料与方法

1．1 材料 健康雄性清洁级SD大鼠100只，质量约180～220 g，普食喂养，购于第四军医大学动物实验中心。BBR（Sigma公司），羧甲基纤维素钠（CMC －Na，solarbio公司），原位缺口末端标记法（TUNEL）检测试剂盒（Roche公司），氯化三苯氮四唑（TTC）检测试剂（Sigma公司），乳酸脱氢酶（LDH）及肌酸激酶（CK）检测试剂盒（南京建成生物公司），NICD抗体（Abcam公司），Hes1、PTEN、Caspase－3、Bcl－2、Bax、cleaved Caspase－3、磷酸化Akt（p－Akt，Ser 473）抗体、Akt抗体（Santa Cruz公司）。

1．2 方法

1．2．1 动物的分组 100只成年雄性SD大鼠随机分为5组（每组20只）：①假手术组（Sham组）：术中不结扎冠状动脉左前降支；②MI／R＋溶剂组（MI／R＋V组）：MI／R手术前，5 g／L CMC－Na溶液给予大鼠灌胃处理1．5 ml／d，2 w；③MI／R＋BBR组：MI／R手术前，BBR 200 mg／kg给予大鼠灌胃处理1．5 ml／d，2 w，BBR溶解于5 g／L CMC－Na溶液制成悬浊液；④Sham＋V组：大鼠给予同上5 g／L CMC－Na溶剂处理2 w后行假手术不结扎冠脉；⑤Sham＋BBR组：大鼠给予同上BBR处理2 w后行MI／R手术。心肌缺血再灌注手术按文献［4］的方法于胸骨左缘2 ～4肋间打开胸腔及心包膜，暴露心脏；在肺动脉圆锥右缘、平左心耳下缘0．5～1 cm处，用6－0丝线围绕前降支打一活结，线结内垫一粗橡胶管，通过拉紧和松开活结模拟心脏缺血和再灌注过程。

1．2．2 心功能检测 MI／R手术后72 h，利用Ve⁃vo770小动物超声仪（VisualSonics，Toronto，Cana⁃da）检测并计算左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）等心功能的变化，测量5个心动周期，取平均值作为检测数据。

1．2．3 心肌梗死范围的测定 再灌注结束后，再次结扎冠脉，向左心室腔注入10 g／L伊文氏蓝（1～2 ml）。迅速取出心脏，冻存于－20℃。用心脏切片器垂直于心脏长轴将其切成1 mm厚的薄片，置于20 g／L TTC（pH 7．4）的6孔培养皿中，于37℃孵育15 min。用数码相机拍照并输入计算机。采用单盲法分别将伊文氏蓝染色区（非缺血区）、TTC染色区（红染，缺血区但组织仍存活）及非TTC染色区（MI区），用Sigma Scan面积测算，Image Pro plus软件进行计算处理。梗死范围以每一心脏总梗死面积（INF）占总缺血区面积（AAR）的百分比表示（INF／AAR×100%）。

1．2．4 心肌细胞凋亡的TUNEL法检测 按TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒的说明书操作。MI／R 6 h后，立即取出心脏，以预冷的PBS冲洗干净，取心尖部约2～5 mm组织。将取下组织切去心脏冠状面最大横径，置于40 g／L甲醇溶液中固定24 h后进行石蜡包埋切片。每张切片在凋亡区随机选取5个以上高倍视野，计数每个高倍视野内凋亡细胞核数，总细胞核数，计算心肌细胞凋亡率（apoptotic index）。

1．2．5 Notch1等蛋白表达的检测 再灌注过程结束后，迅速取出心脏，用预冷的生理盐水冲洗后，剪取缺血区心肌标本，液氮中速冻，置－80℃冰箱中保存待测。取缺血区心肌标本，匀浆、离心后，取上清液分装保存备用。BCA法测定蛋白浓度并进行蛋白定量，经聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离蛋白，用湿转法将蛋白转移到PVDF膜，50 mol／L脱脂牛奶封闭，分别加NICD抗体（Abcam公司，1∶1 000），Hes1、PTEN、Caspase－3、Bcl－2、Bax、cleaved Caspase －3、p－Akt抗体、Akt抗体，稀释比均为1∶500，4℃过夜，TBST洗脱3次，分别加1∶5 000辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，TBST洗脱3次，使用ECL－plus试剂盒发光，通过生化检测系统成像并分析结果，以β－actin作为内参照，检测各蛋白的表达情况。

1．3 统计学处理 实验结果数据均以均数±标准差（Mean±SD）表示，采用Prism 5．0软件进行统计学分析，多组间数据比较采用方差分析（ANOVA），若总体差异显著，再以t检验分析相应两组间的显著性差别。以P＜0．05为差异显著的界限。

2 结 果

2．1 各组心功能的比较 大鼠心肌缺血再灌注72 h后超声心动图显示，与MI／R＋V组相比，MI／R＋BBR组LVEF与LVFS显著提高（均P＜0．05，图1），而单纯溶剂对照组与BBR组对心脏功能无显著影响（均P＞0．05，图1）。

图1　各组心功能的比较

图2　各组心肌细胞凋亡率及INF的比较

2．2 各组心肌细胞凋亡率及INF的比较 大鼠心肌缺血再灌注6 h后留取心肌组织TUNEL凋亡检测显示，与MI／R＋V组相比，MI／R＋BBR组心肌细胞凋亡率显著下降（均P＜0．01，图2A）；再灌注6 h后取心脏进行Evans blue－TTC双染切片统计显示，与MI／R＋V组相比，MI／R＋BBR组INF显著下降（均P＜0．01，图2B），检测血清LDH与CK指标显示与MI／R＋V组相比，MI／R＋BBR组血清LDH与CK水平显著下降（均P＜0．01，图2C，D），Sham组与BBR组对心肌凋亡及梗死无显著影响（均P＞0．05，图2）。

2．3 各组Notch1通路蛋白及凋亡相关蛋白表达的比较 大鼠MI／R 4 h后，留取心肌组织，Western blot检测结果显示，与Sham组相比，MI／R＋V组心肌NICD、Hes1、PTEN表达无显著差异（均P＞0．05，图3B、C及D）。与Sham组相比，MI／R＋V组心肌p －Akt／Akt比值、Caspase－3、Bax及cleaved Caspase－3表达显著上调，Bcl－2表达显著下调（均P＜0．05，图3E－I）。BBR治疗组显著上调NICD、Hes1、p－Akt／Akt比值及Bcl－2表达，下调PTEN、Caspase－3、Bax及cleaved Caspase－3表达（与MI／R＋V组相比，均P＜0．05，图3）。

图3　各组Notch1通路蛋白及凋亡相关蛋白表达

3 讨 论

急性冠状动脉疾病在世界范围内已经成为心血管发病与致死的主要原因。临床上部分患者接受治疗，在恢复血流再灌注后，早期缺血心肌损伤加重，引起更多心肌细胞死亡，心肌梗死面积变大，从而进一步损害心功能，被称为MI／R损伤［8－9］。有研究指出，心肌细胞过度凋亡在MI／R损伤的病理生理过程中发挥重要作用。如何减轻再灌注期间心肌细胞凋亡并维护心功能一直是基础与临床医学研究的热点。

BBR是从黄连或黄柏皮中提炼出来的一种异喹啉生物碱，早期多用于治疗肠道细菌感染性疾病［3］。现代药理学研究证实，BBR具有降血糖、抗肿瘤、抗血小板聚集等作用［4］。最新的研究表明，BBR可以减轻MI／R损伤，发挥心肌保护作用［4，10］。本实验发现，缺血再灌注手术前给予大鼠BBR口服治疗2 w可显著减轻MI／R损伤，减轻心肌细胞凋亡，改善术后心功能。

20世纪80年代，Artavanis Tsakonas研究组首次克隆了Notch基因。迄今为止，在哺乳动物中共发现4类Notch基因，编码4种Notch受体，分别为Notch 1～4［11］。Notch是一种跨膜二聚体受体，在生理条件下，Notch配体通过与受体的结合，启动Notch信号途径，利用α分泌酶和γ分泌酶进行一系列溶蛋白性裂解反应，释放Notch1受体胞内区（NICD）。NICD进而转移到细胞核内，通过连接普遍存在的转录因子、CBF1等调控Hes1基因的表达［5］。研究证明，Notch信号通路在心血管系统的发生、发育及病理生理过程中发挥重要作用［11］。近年来，Notch1受体和其下游信号分子Hes1在缺血性心脏病中的作用越来越受到关注。周等［12］发现MI／R过程中激活Notch1分子可通过激动下游Hes1分子发挥抑制PTEN表达的作用，从而减轻MI／R损伤，而裴等［13］证实，激活心肌Notch1信号通路可通过下游Hes1信号减轻由MI／R损伤引起的氧化应激与硝化应激损伤从而保护缺血心肌。PI3K／Akt信号通路在细胞存活、生长、迁移等过程中亦发挥重要作用，作为心肌缺血过程中的“生存信号”，该信号激活已被证实发挥重要的抗凋亡作用［14］，其不仅在心血管系统中发挥上下游调控作用，信号系统的激活也在多种肿瘤细胞系中发挥重要的促肿瘤生长作用［16－17］。迄今为止，尚无研究报道Notch1／Hes1－PTEN／Akt信号系统在BBR的心肌保护中的作用。本研究发现BBR在保护缺血心肌的同时，激活Notch1／Hes1表达，从而抑制PTEN的表达进而增加Akt磷酸化，从而发挥抗凋亡作用，虽然仍需要进一步实验确证Notch1／Hes1信号与PTEN／Akt信号在此过程中的上下游关系，本研究仍强烈提示BBR的心肌保护作用可能与Notch1／Hes1及PTEN／Akt信号密切相关。

总之，笔者证实：BBR治疗显著减轻MI／R后心肌凋亡与坏死，提高心功能，而BBR的心肌保护作用很可能与其激活Notch1／Hes1信号并调控PTEN／Akt通路从而减轻MI／R心肌损伤相关。本研究揭示了BBR保护缺血心肌新机制，并为BBR相关药物的开发和临床应用提供了实验依据。

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·综 述·

修订日期：（2015⁃08⁃07）

收稿日期：（2015⁃07⁃09）

通讯作者：俞世强，Email：shiqiangyu210＠126．com

基金项目：国家自然科学基金（81470415，81270170，81200151，81470411）；国家十二五科技支撑计划课题（2011BAI11B20）；陕西省国际科技合作与交流计划项目（2015KW－047）；陕西省社会发展攻关计划（2015SF104，2012K15－02－01）；西京医院学科助推计划（XJZT14203，XJGX12C11，XJGX13LC15）