miR—196a在下咽鳞状细胞癌血浆中的表达及其临床意义

邬振华 李群 崔翔 沈志森

[摘要] 目的 探讨miR-196a在下咽鳞状细胞癌（HSCC）患者血浆中的表达水平及其与下咽癌临床因素的关系，明确miR-196a的诊断价值及临床意义。 方法 利用57例临床确诊HSCC患者血浆配对样本，健康体检者血浆样本50例，从血浆标本中提取总RNA，应用实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR，qRT-PCR）方法检测miR-196a在血浆中的表达水平，收集57例HSCC患者病理、临床资料，统计分析血浆miR-196a水平和临床病理特征的关系。构建受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC），探讨血浆miR-196a的诊断价值。结果 在HSCC患者中术前miR-196a的水平9.11（5.69，12.43）显著高于术后12.69（9.16，14.84）及健康体检者12.85（11.18，14.91）（P<0.01）；血浆标本中HSCC患者术后miR-196a水平与健康体检者比较无显著差异（P>0.05）。miR-196a血浆中的表达水平和分化程度（P<0.05）、淋巴结转移（P<0.01）、临床分期（P<0.05）有显著相关性；与年龄、吸烟史无关（P>0.05）。ROC曲线下面积为0.755，截断（cut-off）值为△Ct=10.84，95%CI：0.66～8.85 （P<0.01）。结论 血浆miR-196a血浆表达水平与HSCC患者的肿瘤分期、淋巴结转移、病理类型等若干临床特征相关。miR-196a有望作为HSCC微创诊断分子标志物。

[关键词] miRNA；下咽癌；肿瘤标志物；诊断

[中图分类号] R759.63 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）03-0011-05

下咽癌是耳鼻喉科常见恶性肿瘤之一，发病率有逐年上升趋势，其中约95%为下咽鳞状细胞癌（hypopharyngeal squamous cell carcinoma，HSCC），多发生在梨状窝、下咽后壁及环后区[1，2]。下咽癌起病隐匿，早期难以发现，多数下咽癌患者发现时已伴随肿瘤浸润、颈部淋巴结转移，甚至远处转移，预后较差，主要治疗方法包括手术、放化疗、分子靶向药物治疗[2]。术后患者发音、吞咽功能均受到不同程度影响，5年生存率约31.4%[3]。因此，下咽癌患者的早期诊断，对患者的预后及生活质量影响起着至关重要的作用。但是目前没有可靠的分子标志物诊断下咽癌及预测肿瘤转移，故探索下咽癌诊断分子标志物十分重要。

通过分子生物学研究探索下咽癌的分子机制，为下咽癌的病因研究及诊治提供了新方向。微小RNA（miRNA） 是一种内源性长度为22～25 nt的非编码RNA，它可以通过特异性地与癌基因或者抑癌基因结合，在转录及转录后水平调控基因表达[4-5]，许多研究证明miRNA参与了肿瘤细胞增殖、分化、凋亡过程[4]。Mitchell等通过实验证明miRNA能够在血浆和血清中稳定存在，随后大量研究者证明miRNA可以作为潜在的肿瘤诊断和预后评价的血液标志物[6-8]。本研究通过检测下咽鳞状细胞癌（hypopharyngeal squamous cell carcinoma，HSCC）患者及健康体检者外周血中的miR-196a的水平，探讨其在下咽癌的诊断中的作用。

1资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年1月～2013年11月李惠利医院经手术切除的57例下咽癌手术患者和50例健康体检者血浆标本。下咽癌标本来源均为男性，病理诊断为HSCC；年龄43～81岁，平均60.1岁；术后病理按2002年UICC标准判断下咽癌分期，组织类型及分化程度均由2名以上高年资病理医师确诊。57例下咽癌患者均无慢性肝病及肝、肾功能不全史。术前均未进行放化疗，其中淋巴结转移患者43例，影像学检查未见有明显的其他器官转移灶。健康体检人群无肿瘤病史，年龄40～79岁，平均60.5岁。下咽癌患者和健康查体人群的年龄、性别无统计学差异（P>0.05）。所有入组者均签署知情同意书，并经过医院伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器

MX3005P型全自动荧光定量PCR仪（Stratagene， USA）、NanoDrop2000分光光度计、Trizol LS 裂解液（Invitrogen， USA）、miScript Ⅱ逆转录反应试剂盒（miScript HiSpec Buffer， miScript Reverse Transcriptase Mix）（Qiagen，德国）、miR-196a 10×miScript Primer Assay（Qiagen，德国），Hs_RNU6B_2 miScript Primer Assay（Qiagen，德国）、定量PCR反应试剂盒（Qiagen，德国）。

1.3 标本采集

下咽癌患者的术前血液标本均在术前收集，术后1周收集空腹血液标本。收集后置于ETDA抗凝管中，所有血液自收集至处理时间不超过2 h。血液样本在4℃下、3 000 r/min离心10 min；取上层血浆置于新的1.5 mL无RNA酶的离心管中，随后在4℃下、12 000 r/min 离心10 min，获取的血浆于 -80℃冰箱深度保存。

1.4 总RNA的提取

将临床标本从超低温冰箱中取出，取250 μL血浆置于2 mL离心管中并加入750 μL Trizol LS，反复吹打混匀，在4℃离心机中，12 000 r/min离心10 min后，吸取上清置于1.5 mL去RNA酶离心管中，加入200 μL三氯甲烷，旋涡震荡20 s，然后在4 ℃，12 000 r/min离心15 min后吸取上层水相，加入600 μL异丙醇静置，4℃，12 000 r/min离心15 min，弃上清。加入1 mL 75%酒精，再次混匀。4℃，12 000 r/min离心5 min，弃上清。置于室外干燥 10 min，加入12 μL DEPC水溶解RNA并置于冰上备用。用NanoDrop 2000测定RNA浓度及OD值，OD260/OD280值在1.8～2.0之间的RNA样品可用于逆转录反应。

1.5 实时荧光定量PCR

按照逆转录miScript II Reverse Transcription （RT）试剂盒说明书，将1 μg RNA加入逆转录反应体系转录为cDNA。反应条件为37℃ 1 h，95℃ 5 min。逆转录成功完成后，加入100 μL DEPC水备用。用5 μL cDNA为模板按照miScript SYBR Green PCR试剂盒说明书加入10 μL 2×QuantiTect SYBR Green PCR混合物、1 μL 10×miScript通用引物、1 μL特异性引物、3 μL DEPC水配制20 μL反应体系。采用实时荧光定量PCR技术检测特异性miRNA的表达水平，反应条件为：95℃预变性15 min，94 ℃变性15 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s，实验重复3次。实验结果用阈值循环数Ct（Cycle threshold）来表示，并采用U6小RNA为内参消除标本误差，实验引物均由Qiagen公司设计合成。特异性miRNA的相对表达水平用△Ct值表示，通过Mx3005P PCR System测出每个样品的Ct值，通过公式：△Ct=（CtmiRNA-CtU6）计算△Ct值，△Ct值越高说明样本中表达水平越低。

1.6 统计学处理

采用SPSS17.0 统计学软件，数据均以中位数和四分位数间距表示，本文实验数据样本间变异偏大，故两配对样本组间比较采用Wilcoxon 秩和检验，临床因素相关分组比较采用Mann-Whitney U秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。构建受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve， ROC），评价miR-196a的诊断价值。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR法检测miR-196a表达水平

HSCC患者术前血浆中miR-196a水平9.11（5.69， 12.43）显著高于术后1周表达水平12.69（9.16，14.84）（图1），差异有统计学意义（u=-4.57，P<0.01）。同时，收集50例健康体检者血浆标本并检测miR-196a的表达水平发现，HSCC患者术前血浆中miR-196a水平亦显著高于正常体检者水平12.85（11.18，14.91）（u=-4.53，P<0.01）（图2）。患者术后1周血浆中miR-196a的表达水平降至和正常人群血浆水平无显著性差异（u=-0.69，P>0.05）。

图 1 下咽癌患者术前血浆miR-196a水平明显高于术后（P<0.01）

图2 下咽癌患者术前血浆miR-196a水平显著高于健康体检人群（P<0.01）

2.2 下咽癌外周血血浆中miR-196a水平与临床资料相关性分析

HSCC患者血浆miR-196a的水平与年龄（u=-0.36， P>0.05）、吸烟史（u=-0.60，P>0.05）等临床因素无关，差异无统计学意义。HSCC患者血浆miR-196a水平与其淋巴结转移相关（u=-3.78，P<0.01），淋巴结转移组miR-196a 血浆中的表达水平显著高于无淋巴结转移组。在中低分化组中miR-196a血浆中的表达水平显著高于高分化组（u=-2.49，P<0.05），且Ⅰ、Ⅱ期患者血浆中miR-196a显著低于Ⅲ、Ⅳ期患者（u=-2.13，P<0.05）。见表1。

表1 下咽癌病例临床特征与miR-196a水平的相关分析

2.3 miR-196a对下咽鳞状细胞癌的诊断价值

通过构建ROC曲线并计算CI，探讨miR-196a能否作为HSCC的诊断标志物的意义。ROC曲线下面积为0.755， cut-off值为10.84，95%CI为0.66～8.85（P<0.01），见封三图2。

3 讨论

血液检测是患者住院检查中的常规检测项目，血液标本较组织标本更易于采集，且创伤小。甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖蛋白抗原153（CA-153）等血液肿瘤标志物已广泛用于临床。有研究证明miRNA 可与肿瘤相关靶基因的3非编码区（untranslated regions，3UTRs）结合并在转录水平使其降解，调节相关基因的表达，从而影响肿瘤发生、发展过程[9]。许多miRNA发挥着癌基因或者抑癌基因的作用[6-8]，并逐渐被用于肿瘤诊断并成为预后和疗效评估的潜在标志物[10]。通过检测血浆中miRNA等肿瘤标志物的表达水平，有利于为肿瘤早期筛查、诊断提供依据。

下咽癌发病率呈现上升趋势，此病起病隐匿，病理类型多为中低分化鳞状细胞癌。肿瘤的病理分期、临床分期、淋巴结转移程度是影响下咽癌预后的重要因素。许多miRNA参与下咽癌的发生、发展、转移过程[11]。Orosz等[12]通过miRNA基因芯片技术构建下咽癌的miRNA表达谱，并证明miR-21、miR-143、miR-155在下咽癌中显著高表达。Hsu等[13]收集包括HSCC在内的头颈部鳞状细胞癌的血浆标本后检测发现miR-21水平在术前血浆标本中较高，且显著高于术后血浆标本和健康对照组，提示miR-21是头颈鳞状细胞癌的新型的生物标志物。同时Liu等[14]发现miR-21可以通过抑制PTEN基因表达参与下咽癌的发生过程。还有研究显示miR-504、miR-451a在HSCC中发挥着抑癌基因的作用[15，16]。

miR-196a由MIR-196A1（17q21.32，RP11基因）和MIR-196A2（12q13.13，HOX基因簇）基因转录并加工形成成熟的miRNA。许多研究表明miR-196a在恶性肿瘤中高表达，如食道癌、胰腺癌、结肠癌、肺癌等[17-19]。Luthra等[17]实验证明miR-196a在包括食道癌、子宫内膜癌、乳腺癌等在内的12种细胞系中高表达，通过抑制miR-196a的表达后，发现与细胞增殖、凋亡有关的膜联蛋白A1和miR-196a的表达呈负相关。Slater等[20]通过对胰腺癌患者外周血中miR-196a的检测发现，miR-196a在术前血中表达上调，肿瘤切除术后降至正常水平。Saito等[21]通过基因芯片技术筛选出喉癌组织标本的miRNA芯片表达谱发现，miR-196a在喉癌组织标本中高表达，通过大样本实验验证芯片结果，并进一步研究证实miR-196a参与了喉癌细胞的增殖过程。目前关于血液中检测miR-196a的相关研究不多，且尚缺乏miR-196a和下咽癌关系的研究，因此本研究结合病理临床因素分析miR-196a在血浆中的水平和下咽癌之间的关系并研究其诊断价值。

本研究表明，下咽癌术前血浆miR-196a水平明显高于术后，且显著高于健康体检者血浆水平。通过构建ROC曲线分析miR-196a的诊断价值发现，ROC曲线下面积达0.755。吸烟是导致头颈部肿瘤的致病因素之一[22]，肿瘤的临床分期、淋巴结转移及分化程度往往影响肿瘤患者的预后，因此本研究结合以上临床因素进行相关性分析表明，血浆miR-196a水平和肿瘤的分期相关，晚期下咽癌血浆标本中的表达量显著高于早期下咽癌患者血浆中miR-196a的水平（P<0.05）。研究进一步表明，合并淋巴结转移的患者血浆中miR-196a水平也显著提高（P<0.01），且中-低分化下咽鳞状细胞癌患者中miR-196a较高分化患者高表达（P<0.05）。表明miR-196a可能是下咽鳞状细胞癌的癌基因，miR-196a可能参与了肿瘤发生、发展的生物学过程。

目前尚无特异性的下咽癌血液诊断标志物，本研究将为今后下咽鳞状细胞癌的诊断标志物的研究奠定基础，并为进一步探讨下咽癌发生的分子生物学机制提供理论依据，miR-196a有望成为下咽癌诊断的潜在标志物和基因治疗靶点。

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（收稿日期：2014-10-28）