新型接头蛋白CARD10在结直肠癌中的表达与意义

赵婷婷　刑鹏　李继光

·论著·

新型接头蛋白CARD10在结直肠癌中的表达与意义

赵婷婷刑鹏李继光

【摘要】目的检测CARD10(caspase recruitment domain family member 10)蛋白在结直肠癌组织及其癌旁粘膜组织中的表达水平，结合临床病理资料，探讨CARD10与结直肠癌患者临床病理特征的关系。方法利用免疫组化方法检测147例结直肠癌组织及其癌旁粘膜组织中的CARD10表达情况，使用SPSS 19.0软件进行统计分析。结果在结直肠癌组织和癌旁黏膜组织中，CARD10阳性表达分别为46例(31.29%)和10例(6.80%)，CARD10在结直肠癌中的表达上调(P<0.01)。CARD10在结直肠癌组织中的表达与肿瘤的TNM分期(P<0.01)、浸润深度(P<0.05)、淋巴结转移(P<0.01)、远处转移(P<0.05)以及Ki-67表达明显相关(P<0.01)。结论CARD10在结直肠癌的发生发展中可能发挥着肿瘤促进因子的作用。

【关键词】结直肠肿瘤；免疫组织化学；CARD10

作者单位：110000沈阳，中国医科大学肿瘤研究所

结直肠癌是世界最常见的肿瘤之一，在所有肿瘤中，结直肠癌的死亡率位列第二[1]。尽管结直肠癌根治术和术前、术后放化疗已被广泛应用，但结直肠癌的生存率仍不乐观。因此，找到更多的结直肠癌的生物治疗靶点十分必要。

转录因子NF-κB(nuclear factor kappa B)可以上调多种促癌基因进而参与调控包括结直肠癌在内的多种肿瘤的发生发展[2-6]。溶血磷脂酸LPA(Lysophosphatidic acid)能够通过结合G蛋白偶联受体进而激活核转录因子NF-κB的活性[7-8]。近年来有文献报道新型接头蛋白CARD10(caspase recruitment domain family,member10)能通过参与LPA-G蛋白偶联受体激活NF-κB的过程，进而调控NF-κB的靶基因表达，从而调控多种恶性肿瘤的发生和发展[9-10]。目前，已有文献报道CARD10的异常表达与膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌等恶性肿瘤的临床分期相关[11-14]，但尚无文献研究CARD10与结直肠癌的临床特点的关系。因此，在本研究中，我们采用免疫组化技术检测CARD10蛋白在结直肠癌组织中的表达水平，同时结合临床病理资料，进一步探讨CARD10与结直肠癌患者临床病理特征的关系。

资料与方法

一、一般资料

本研究收集2006年至2008年中国医科大学附属第一医院肿瘤外科切除的结直肠癌及其癌旁正常粘膜组织标本各147例。全部患者均未接受术前放疗或化疗，并且有完整的临床病理资料。组织学分类根据WHO组织学分类标准划分，临床分期根据第七版结直肠癌TNM分期标准划分。所有标本均采用武汉博士德公司的SABC法免疫组化试剂盒进行染色。简要过程如下：石蜡包埋组织，常规切片(4 um)，组织切片常规脱蜡、水化，双氧水阻断内源性酶，缓冲液微波修复，室温冷却35分钟，加入一抗抗人CARD10兔多克隆抗体(1：1000稀释，Sigma，美国)或抗人Ki-67鼠单克隆抗体(1：500稀释，Abcam，美国)于湿盒中37℃孵育4小时(PBS为阴性对照),加入二抗,置于湿盒中37℃孵育45分钟,加入SABC液于湿盒中孵育30分钟，最后加入后二氨基联苯胺(DAB)显色液显色1～2 min,加入苏木素复染液中复染4 min,盐酸酒精分化,梯度酒精透明，中性树胶封片。

二、免疫组化结果判定

CARD10免疫组化染色结果基于染色强度和染色阳性细胞比例进行综合评分。评分标准如下。染色强度：细胞无染色为0分；细胞呈浅黄色为1分；细胞呈深黄或深棕色为2分。阳性染色细胞比例：无阳性染色细胞为0分；阳性染色细胞比例1~5%为1分；阳性染色细胞比例6%~25%为2分；阳性染色细胞比例26%~75%为3分；阳性染色细胞比例75~100%为4分。上述两种判断标准得分乘积为最终计分结果：0~3分为阴性表达；4~8分为阳性表达。Ki-67免疫组化染色结果基于阳性染色细胞比例，阳性染色细胞比例≥40%为Ki-67阳性表达，<40%为Ki-67阴性表达。

三、统计学方法

利用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析。利用卡方检验计算CARD10表达与临床病理资料的关系，所有检验均以P<0.05为检验标准。

结　　果

免疫组化染色结果显示，CARD10蛋白主要表达于细胞的细胞质中(图1)。在癌旁黏膜组织中，CARD10阳性表达为10例(6.80%)，与之相反，在结直肠癌组织中，CARD10阳性表达为46例(31.29%)。CARD10在结直肠癌组织中表达明显上调(P<0.01)。卡方检验结果表明，CARD10在结直肠癌组织中的表达与肿瘤的TNM分期(P<0.01)、浸润深度(P<0.05)、淋巴结转移(P<0.01)、远处转移(P<0.05)以及Ki-67表达明显相关(P<0.01)，而与性别、年龄、分化程度无明显相关性(P>0.05，表1)。从表1可以看出，与CARD10阴性表达患者相比，CARD10阳性表达的患者TNM分期及T分期更晚，并且发生淋巴结转移、远处转移和Ki-67阳性的概率增加。

讨　　论

大多数肿瘤均可以观察到NF-κB的活化，并且活化的NF-κB可以调控肿瘤的进展。据报道，NF-κB活化后可以调控肿瘤的增殖、侵袭、迁徙、血管生成、炎症反应、放化疗抵抗等[15]。肿瘤中NF-κB活化的途径是近年来研究的热点，LPA通过结合G蛋白偶联受体进而激活NF-κB的活性是一条经典的途径[7-8]。近年来发现，CARD10能通过参与LPA-G蛋白偶联受体激活NF-κB的过程，实现对NF-κB活性的调控，进而调控NF-κB的靶基因的表达[9-11]。因此，研究者们开始注意到CARD10对肿瘤的调控作用。Xie等报道，在卵巢癌中上调CARD10的表达可以通过调控cyclin D1,cyclin E,and Bcl-2的表达进而增强卵巢癌细胞的增殖活性和化疗抵抗能力[16]。Du等报道，在胰腺癌中，下调肿瘤细胞的CARD10表达可以降低细胞的增殖、迁徙和侵袭能力，并且这种调控作用是通过NF-κB的靶基因Bcl-10介导的[13]。更重要的是，研究者们发现了CARD10在肿瘤中的表达与患者的临床病理特点有着紧密的联系[11-14]。但目前尚无文献报道CARD10在结直肠癌中的表达与意义。

表1　CARD10的表达与临床病理资料关系表

在本研究中，我们利用免疫组化在107例结直肠癌组织及癌旁粘膜组织检测了CARD10的表达情况并且结合临床病理治疗进行了细致地分析。我们发现与癌旁粘膜组织相比，CARD10在结直肠癌组织中表达明显上调，提示CARD10可能与结直肠癌的发生发展密切相关。进而我们研究了CARD10在结直肠癌中的表达情况与临床病理资料的关系，我们发现CARD10的表达与肿瘤的TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移以及Ki-67表达明显相关。与CARD10阴性表达患者相比，CARD10阳性表达的患者TNM分期更晚，浸润深度更深、并且发生淋巴结转移、远处转移和Ki-67阳性的概率增加。这个结果进一步说明了CARD10参与了对结直肠癌进展的调控，并且发挥着肿瘤促进因子的作用。这个结果也提示了CARD10很有可能是结直肠癌的一个治疗靶点。

众数周知，TNM分期是结直肠癌最重要的分期系统，TNM分期与患者预后极其相关[17]。同样，淋巴结转移、远处转移以及Ki-67的表达状态亦是结直肠癌十分重要的预后因素[18-20]。鉴于本研究发现CARD10的表达与上述4个预后因素密切相关，我们推断CARD10阳性表达患者与阴性表达患者有预后差异，并且CARD10很有可能是结直肠癌的独立预后因素。我们将会在未来的研究中检验这一推断。

CARD10在结直肠癌中的表达升高，并且与结直肠癌的TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移以及Ki-67表达明显相关，提示CARD10在结直肠癌的发生发展中可能发挥着肿瘤促进因子的作用。

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(本文编辑：马天翼)

赵婷婷，刑鹏，李继光.新型接头蛋白CARD10在结直肠癌中的表达与意义[J/CD].中华结直肠疾病电子杂志，2015，4(1)：58-61.

Expression and the significance of caspase recruitment domain family member10 in colorectal cancer

ZHAOTing-ting，XINGPeng，LIJi-guang

.TumorResearchInstituteofChinaMedicalUniversity，Shenyang110013，China.

Correspondingauthor：LIJi-guang，Email：13898829926@163.com.

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and the significance of CARD10(caspase recruitment domain family member 10)in colorectal cancer.MethodsThe expression of CARD10 was detected by immunohistochemistry.The statistic analysis was performed by SPSS 19.0.ResultsOverexpression of CARD10 was found in 46(31.29%)patients and 10(6.80%)patients in colorectal cancer tissues and tumor-adjacent mucosae,respectively.CARD10 was overexpressed in colorectal cancer(P<0.01).Overexpression of CARD10 in colorectal cancer correlated with TNM stage(P<0.01),tumor depth(P<0.05),nodal metastasis(P<0.01),distant metastasis(P<0.05),and Ki-67 status(P<0.01).ConclusionThis study demonstrated that CARD10 may play a role as tumor-promoting factor in colorectal cancer.

【Key words】Colorectal neoplasms；Immunohistochemistry；CARD10

(收稿日期：2015-01-20)

通讯作者：李继光，Email：13898829926@163.com

基金项目:国家自然科学基金(81302125)

DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2015.01.13