蛇葡萄素对肾癌786-O 细胞增殖和凋亡的作用＊

柯 军，冯继红

（1.贵州省人民医院药剂科，贵阳550000；2.遵义医学院附属医院肿瘤医院，贵州遵义563003）

蛇葡萄素（ampelopsin，AMP）其化学名称为3，5，7，3′4′5′-六羟基-2，3双氢黄酮醇，是藤茶的主要活性成分。藤茶味甘、性凉，又称为甜茶、甘露茶等，主要分布于广西、湖南、福建等地，具有清热解毒、提高免疫力等作用，多用于上呼吸道感染发热、消炎止痛、消肿利尿等的辅助治疗［1-3］。已有研究表明，AMP有抑制人类肿瘤的作用，包括膀胱癌、乳腺癌和肝癌等［4-7］，但AMP对肾癌的作用却少见报道。为研究AMP对肾癌786-O 细胞增殖和凋亡的影响，2014年2月至2015年1月笔者设计并进行了如下药理实验。本研究采用MTT 法和流式细胞检测方法，探究AMP对体外人肾癌786-O 细胞增殖与凋亡的作用，为AMP 对肾癌的治疗提供一定的实验依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人肾癌786-O 细胞株购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂 含量为98%的AMP（西安瑞林生物科技有限公司）；胎牛血清及磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国Hyclone公司；Annexin V／PI双染试剂盒（美国BD 公司）；溴化噻唑蓝（MTT）购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养基，0.25%胰酶二甲基亚枫（DMSO），青霉素、链霉素双抗购自美国Gibco公司；其余均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱（Thermo公司）；电子分析天平（余姚纪铭公司）；酶标仪（Bio-TEK 公司）；流式细胞仪（Becton Dinckingson）；台式低速离心机（Thermo公司）；12 孔及96 孔细胞培养板、培养瓶（美国Gibco公司）；高压蒸汽灭菌器（韩国Lab Tech公司）；超低温冰箱（海尔公司）；微量加样器（Thermo公司）；超净工作台（苏州安泰公司）。

1.2 方法

1.2.1 AMP、MTT、PI配制 （1）将AMP 粉末溶解于DMSO，制成浓度为64 mg／mL 的药物原液，保存于4 ℃低温冰箱，使用时用RPMI-1640培养液稀释成所需的药物浓度。（2）用无血清的RPMI-1640 培养液配制成浓度为5 mg／mL 的MTT 溶液，现用现配。（3）将PI溶液与RNaseA 按1∶1的比例溶解于适量PBS中，配制成PI染液。

1.2.2 细胞培养 将肾癌786-O 细胞置于RPMI-1640培养基中（含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗），于5% CO2、37 ℃、饱和湿度的培养箱中进行培养，待细胞长满培养瓶壁时（70%～80%）进行消化传代（0.25%的胰酶消化），取对数生长期的细胞用于如下实验。将其分为正常组和AMP组。

1.2.3 MTT 法检测细胞增殖抑制率 取肾癌786-O 细胞（对数期生长期），将其接种于96 孔板，调整细胞浓度至1×104／孔。培养24h后，于每孔内加入适量的AMP使其终浓度分别为0、5、10、15、20、25和30μg／mL，每组均设3个复孔。继续培养48h后，弃去各孔内液体，于每孔内加入浓度为5 mg／mL 的MTT 溶液（避光操作）。再次孵育4h后，吸去各孔上清液，每孔内加入150μL DMSO 溶液并混匀，待其完全显色后，于酶标仪上用492nm 波长测定光密度（OD）值（OD492）。该实验重复3次，按下述公式计算AMP对肾癌786-O 细胞的增殖抑制率：抑制率＝（1-OD实验／OD对照）×100%。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 采用Annexin V／PI荧光双染法检测细胞凋亡率。取对数生长期的细胞，用RPMI-1640培养液（无血清）调整细胞浓度至3×105／mL，将其接种于12孔细胞培养板上（每孔1.5mL），缓慢吹打混匀。过夜培养后，加入不同浓度的AMP 药液100μL，使其终浓度为80、40、20、10及0μg／mL（加入100μL 同体积PBS），培养7h后收集各组细胞，PBS 清洗3 次，用PBS 调节细胞浓度至1×106／mL。加入Annexin V 液和已配置好的PI液各5μL（避光操作），将其混匀，孵育20min（室温避光），于流式细胞仪检测并分析各组细胞凋亡率。该实验重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件进行分析，计数资料用率表示，采用χ2检验；计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 观察各组肾癌细胞的形态 于倒置相差显微镜下观察，正常肾癌786-O 细胞呈贴壁生长，形态良好，排列紧密，可见透光性好。经AMP处理后，部分细胞失去了贴壁性，呈现悬浮生长；大部分细胞表现为形态皱缩，失去原有形状；细胞内颗粒增多，细胞器形态异常，可见一部分细胞已死亡，见图1。

图1 正常组及AMP 20μg／mL处理组72h肾癌786-O 细胞形态（×100）

2.2 不同浓度AMP抑制增殖的作用 经不同浓度AMP 处理后，肾癌786-O 细胞的增殖抑制率，见表1。当AMP浓度在5～30μg／mL 时，随着AMP 浓度升高，肾癌786-O 细胞抑制作用逐渐增强，即两者呈量效关系，其半数抑制浓度（IC50）为17.23μg／mL。

2.3 不同浓度AMP 对肾癌细胞凋亡的作用 经不同浓度AMP处理72h后，凋亡的肾癌786-O 细胞明显比AMP 0μg／mL组增多，见表2。不同浓度的AMP 对肾癌786-O 细胞凋亡率的作用不同。通过各组间进行两两比较，AMP 10μg／mL组和AMP 20μg／mL 组差异无统计学意义（P＞0.05），AMP 40μg／mL组和AMP 80μg／mL 之间差异无统计学意义（P＞0.05）；但80μg／mL和40μg／mL的AMP组分别与20μg／mL和10μg／mL 的AMP 组两两比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。由图3条形统计图可以看出，AMP 80μg／mL和AMP 40μg／mL组肾癌786-O 细胞的凋亡率明显高于AMP 20μg／mL、AMP 10μg／mL组，差异有统计学意义（P＜0.05），即80 μg／mL和40μg／mL 的AMP 较20μg／mL 和10μg／mL 的AMP更能有效地促进肾癌786-O 细胞凋亡。

表1 不同浓度AMP对人肾癌786-O 细胞的增殖 抑制作用（±s）

表1 不同浓度AMP对人肾癌786-O 细胞的增殖 抑制作用（±s）

-：表示此项无数据。

组别 n 抑制率／%AMP 0μg／mL组3-AMP 5μg／mL组 3 6.45±1.01 AMP 10μg／mL组 3 11.27±3.42 AMP 15μg／mL组 3 30.13±7.37 AMP 20μg／mL组 3 62.76±9.02 AMP 25μg／mL组 3 85.23±5.22 AMP 30μg／mL组3 95.23±4.28

表2 不同浓度AMP对人肾癌786-O 细胞的凋亡作用

图2 不同浓度AMP对人肾癌786-O 细胞凋亡率的比较

3 讨 论

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）即肾癌，是最常见的肾实质恶性肿瘤，在成年人恶性肿瘤中约占2%～3%，近年来发病率逐渐升高［8］。迄今为止，肾癌的主要临床治疗手段仍是外科手术治疗，内科化疗及放疗治疗均不能有效根治肾癌。然而，随着生物—心理—社会医学模式的建立，改善中晚期癌症患者的生活质量日益受到重视。生物治疗已经成为中晚期肾癌治疗的研究热点及临床治疗的新方向。

目前，抗肿瘤药物的研究热点主要集中在寻求治疗效果显著、毒性小、不良反应少、安全的抗肿瘤药物，而这些药物的有效成分多是从天然植物中提取出的。黄酮类药物多与糖结合成苷类而普遍存在于植物中，小部分以游离态的形式存在，是植物的次生代谢化合物［9］。该类化合物结构复杂、数量和种类繁多，具有抗肿瘤、消炎止痛及抗氧化等多种药理功效［10］。黄酮的主要的药理成分是AMP，其普遍存在于藤茶等植物中且含量十分丰富［11］。已有研究表明，AMP不仅可显著抑制消化道肿瘤细胞增殖，还可显著抑制其他系统肿瘤细胞，但具体的分子机制仍未阐明［4-7，12-15］。

本研究通过观察细胞形态、MTT 实验发现，AMP（20μg／mL）作用72h后，能明显抑制肾癌786-O 细胞；AMP 浓度为30μg／mL时，细胞抑制率可达到90%以上，大部分细胞失去活性或死亡；表明AMP能显著抑制肾癌786-O 细胞增殖。流式Annexin V／PI双染法是测定细胞凋亡的敏感的方法之一，通过双重荧光标记（Annexin V-FITC 和PI）可以清楚辨别并统计出早期凋亡细胞的比例。本研究采用流式细胞学方法，探究AMP对体外人肾癌786-O 细胞凋亡的作用。经AMP处理72h后，即可发现肾癌细胞的凋亡率显著上升，在一定的浓度范围内达到最大凋亡率，如10～20μg／mL、40～80μg／mL 之间，肾癌细胞凋亡率不会随着AMP 的浓度增加而增加，而浓度为40、80μg／mL能有效促进人肾癌786-O 细胞凋亡，这可能跟AMP的量效浓度有关［3，10］。

综上所述，AMP可显著抑制肾癌细胞增殖，促进肾癌细胞凋亡，从而起到抗肿瘤的作用，为AMP 的生物治疗作用提供一定的实验依据，为泌尿系统常见恶性肿瘤肾癌的治疗提供了新的线索。然而AMP 作用于肾癌的具体分子机制目前仍不明确，需进一步深入研究。

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