强化他汀对大鼠心肌梗死后血小板活化及炎症的影响＊

唐显军，钟艺华，南映瑜

（重庆市肿瘤研究所内科 400030）

血小板的聚集活化及炎症介质的释放在急性冠状动脉综合征（ACS），尤其是它的急性心血管事件心肌梗死中占非常重要的作用。他汀类药物的常规应用通过降低血脂水平，稳定斑块使这一类人群获益。近来有研究发现，他汀类药物的使用可减少静脉血栓栓塞［1］，而高脂血症本身并不是静脉血栓栓塞的危险因素，进一步的研究发现高脂血症患者循环血中血小板的活性有明显的增高，通过他汀降低血小板活性可减少血栓栓塞事件的发生，此为他汀类药物多效性中抗血小板机制。炎性反应贯穿于动脉粥样硬化，超敏C-反应蛋白（hs-CRP）是肝细胞分泌的一种急性时相性蛋白，是常见的非特异性促炎介质，是急性冠状动脉综合征的独立危险因子［2］。TNF-α是由单核巨噬细胞分泌的一种促炎介质，在调节炎症和免疫反应中起核心作用。因此，调节血清hs-CRP、TNF-α等炎症介质的水平可能是目前治疗急性冠脉综合征的新途径［3］。他汀类药物有独立于降脂作用以外的抗炎作用，即在降脂作用尚未显现时，他汀类的抗炎效应已经发生。故本研究就强化他汀对心肌梗死术后短期血小板活化及炎症因子的影响做一初步探讨。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 单克隆抗体FITC-PAC1、PE-CD62p、PerCPCD61及相应二抗FITC-IgM，PE-IgG1购自美国BD Pharmingen公司；hs-CRP试剂盒购自美国Beckman公司；TNF-α试剂盒购自美国R＆D 公司。

1.2 用药及分组 将70只健康雄性SD 大鼠，体质量250～300g，分为5组，每组14只，分别为（1）假手术组（SHAM 组）：开胸后只穿线，不结扎。（2）心肌梗死对照组：结扎左冠状动脉前降支（见后）。（3）常规剂量组：予以阿托伐他汀10 mg·kg-1·d-1干预14d后，于第15天造AMI模型。（4）强化他汀组：于造模前12h予以阿托伐他汀50mg／kg灌胃后次日造模。（5）阿托伐他汀常规小剂量＋术前强化组（混合剂量组）：予以阿托伐他汀10mg·kg-1·d-1灌胃干预13d，于第14天（术前12h）予以阿托伐他汀50mg／kg强化，于第15天造模。以上阿托伐他汀均溶于2mL 蒸馏水中灌胃，假手术组、心肌梗死对照组术前给予蒸馏水2mL灌胃。

1.3 心肌梗死大鼠模型的建立 腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg／kg）麻醉，整个胸部祛毛，气管切开及气管插管后，左正中旁切开皮肤开胸，结扎左冠状动脉前降支。以心电图肢导联ST 段弓背向上抬高持续0.5h以上作为梗死模型复制成功的标志。

1.4 标本采集 分别于造模后24h，予颈静脉采血法［4］：双人操作，不麻醉大鼠，手法固定，予小儿头皮针接2mg·kg-1·d-1空针先用针头沿胸前正中线约第4肋骨水平右旁开刺入向颈静脉方向进针，接近颈静脉时，助手轻抽注射器呈负压，再以30°～40°角向颈静脉刺入，有血液自动流入注射器内筒，说明针尖已在颈静脉内，此时固定好人鼠，勿使注射器针头移动，颈静脉采血1.5mL收集注入非抗凝管中离心取血清冻存测hs-CRP、TNF-α，换针筒后再抽1mL血沿试管壁缓慢注入含0.1 mL的3.8%枸掾酸钠的试管中，轻轻混匀。从中吸5μL 全血分别加入对照管和实验管，对照管管中加入FITC-IgM、PEIgG1及PerCP-CD61 单抗各20μL，在实验管中分别加入FITC-PAC1、PE-CD62p及PerCP-CD61 单抗各20μL。室温避光放置20min后，用1%PFA 250μL固定10min，1h之内完成样品制备并上机检测。流式细胞仪用FACS Calibur（美国BD Pharmingen公司）进行测试，激发光为氩离子激光器，488nm 单谱线，输出功率为15 mw。对每个实验样品检测10 000个血小板。hs-CRP 采用免疫透射比浊法测定，TNF-α采用酶联免疫吸附法测定，严格按照说明书操作。

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0 软件进行统计分析，计量资料用±s表示，组间比较采用t检验；计数资料以率表示，组间比较采取χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血小板活化标志物比较 与SHAM 组比较，心肌梗死对照组术后24hCD62p和血小板活化因子-1（PAC-1）的表达明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。强化他汀组血小板活化标志物CD62p和血小板活化因子-1（PAC-1）显著低于心肌梗死对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠术后24h血小板活化标志物CD62p、 PAC-1相对表达量（±s，%）

表1 各组大鼠术后24h血小板活化标志物CD62p、 PAC-1相对表达量（±s，%）

a：P＜0.05，与SHAM 组比较；b：P＜0.05，与心肌梗死对照组比较。

组别 n CD62p PAC-1 SHAM 组14 5.78±0.84 11.23±2.45心肌梗死对照组 14 18.23±4.63a 33.12±6.74a强化他汀组 14 10.37±3.27b 19.56±3.26b常规剂量组 14 14.86±4.31 26.62±4.58混合剂量组14 9.24±3.14 17.84±3.17

2.2 血浆炎症因子比较 与SHAM 比较，心肌梗死对照组术后24hTNF-α、和hs-CRP的浓度明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。强化他汀组炎症因子TNF-α、hs-CRP 的浓度显著低于心肌梗死对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠术后24h血浆炎症因子TNF-α、 hs-CRP浓度（±s）

表2 各组大鼠术后24h血浆炎症因子TNF-α、 hs-CRP浓度（±s）

a：P＜0.05，与SHAM 组比较；b：P＜0.05，与心肌梗死对照组比较。

组别 n TNF-α（ng／L） hs-CRP（mg／L）SHAM 组14 102.36±42.79 4.12±0.93心肌梗死对照组 14 277.87±89.31a 10.87±2.15a强化他汀组 14 165.74±53.72b 6.13±1.76b常规剂量组 14 213.48±78.63 8.91±2.02混合剂量组14 131.19±49.17 5.92±1.39

强化他汀组与混合剂量组相比较，炎症因子、血小板活化标志物水平差异无统计学意义（P＞0.05），常规剂量组在心肌梗死大鼠术后与心肌梗死对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、2。

3 讨 论

CD62p，PAC-1是血小板活化的表面标志物，生理状况下，血小板不表达或少量表达，在病理或物化刺激作用下，血小板活化，血小板膜糖蛋白分子的种类、数量和构型发生显著变化，CD62p暴露于血小板膜表面，GPⅡb／Ⅲa在活化时几乎全部表达在膜表面［5-6］。CD62p的表达可以在活化血小板表面持续下去，并不会被血浆蛋白质所掩盖［7］。CD62p通过介导血小板和血管内皮细胞与单核细胞、嗜中性粒细胞间的相互黏附，导致细胞大量聚集，在炎症和栓塞中起着很重要的作用［8］。

影响血小板活化的因素很多，比如麻醉、手术，血小板易受到抗凝剂和离体时间的影响，血小板活化后其聚集性会增加，并且会发生形状的改变。要避免任何可能导致血小板意外激活的因素，必须尽可能做到顺利采集标本，及时送检，改进抗凝剂使用方法［9］。本研究采用颈静脉采血，手法固定，不麻醉大鼠，以及血样固定后1h内上机检测均为最大程度降低人为的，体外对血小板的活化。PAC-1在血小板表面的表达量可以精确地反映早期阶段血小板的活化［10］，CD62p的升高可作为血栓性疾病病情监测和评价血栓前状态的有效指标。本研究发现：心肌梗死对照组与SHAM 组比较，术后24h血小板活化表面标志物PAC-1、CD62p显著性增高；强化他汀组血小板活化标志物显著低于心肌梗死对照组；强化他汀组与混合剂量组相比较，血小板活化标志物水平差异无统计学意义（P＞0.05）；常规剂量他汀在心肌梗死大鼠术后短期与心肌梗死对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本实验表明急性心肌梗死术后血小板发生显著活化，而术前强化他汀可以抑制术后血小板的这种活化，从而降低进一步血栓事件的发生，而达到有效保护心肌的目的。而低剂量的他汀药物持续给药在本研究中未观察到它在急性心肌梗死术后短期产生的活化抗血小板的有益作用，本研究差异无统计学意义（P＞0.05）。至于持续低剂量联合术前一次性负荷剂量的他汀药物是否可以在心肌梗死术后产生比术前单次负荷剂量更强的抑制血小板活化作用，本研究只是在实验结果中看到这种趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

急性冠状动脉综合征的发生与机体炎性反应激活有关，早期应用大剂量阿托伐他汀能快速降低血清炎症因子水平，从而改善机体的炎症状态，有助于冠状动脉病变斑块的稳定，从而有可能影响急性冠状动脉综合征患者的转归［11］。有临床研究显示强化他汀治疗不稳定型心绞痛具有较好的临床效果及安全性，能明显降低血清hs-CRP、TNF-α水平，具有良好心血管保护作用［12］，急性炎性反应在此过程中起了关键性作用。强化他汀缘于它迅速起效的多效性，服用3h 后即可改善内皮功能，24h 内改善冠状动脉循环，降低炎症因子水平［13］。本研究发现，心肌梗死对照组与SHAM 组比较术后24h急性炎症因子TNF-α、hs-CRP水平明显升高，强化他汀组炎症因子水平显著低于心肌梗死对照组；强化他汀组与混合剂量组相比较，炎症因子水平差异无统计学意义（P＞0.05），常规剂量组在心肌梗死大鼠术后短期与心肌梗死对照组比较差异亦无统计学意义（P＞0.05）。说明心肌梗死手术迅速激活大鼠体内炎症介质的释放，而术前强化他汀可以抑制术后大鼠体内炎症因子水平，通过改善机体的炎症状态，影响心血管病变的转归而起到有益作用。而低剂量他汀持续给药在本研究中未显示出他汀多效性的抗炎效应。

综上所述，术前强化阿托伐他汀能显著降低心肌梗死大鼠术后24h急性炎性反应，抑制血小板活化，而炎症和血小板活化的关系，以及他汀多效性的起效及持续时间等问题尚需进一步研究。

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