人乳腺癌细胞微球体生物学特性研究

范原铭，侯 婧，董 宁，王 强，顾 敏

（1.重庆市长寿区人民医院普外科 401220；2.重庆市长寿区人民医院肿瘤科 401220；3.重庆市长寿区妇幼保健院外科 401220）

乳腺癌作为威胁我国妇女生命健康的头号肿瘤杀手，由于其发病率呈逐年上升趋势，故越来越成为众多学者关注和研究的重点。而随着对肿瘤的研究深入，“肿瘤干细胞”的理论应运而生。肿瘤干细胞是指一小部分具有自我更新以及多向分化潜能，并且具有极强的成瘤能力的肿瘤细胞。这类细胞可以不断分化、增殖出新的肿瘤细胞，具有了无限增殖以及远处转移的特点。本文拟利用人乳腺癌无血清悬浮培养的方法获得具有肿瘤干细胞特性的人乳腺癌细胞微球体（mammospheres，MSs），并通过细胞划痕实验、transwell实验及动物成瘤实验来了解MSs所具有的生物学特性，以期为MSs应用于乳腺癌干细胞研究提供实验模型。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7 细胞（中科院上海细胞库）；DMEM-F12、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、上皮特异性抗原EDA、红细胞裂解液（鼎国生物公司）；BALB／c雌性裸鼠（重庆医科大学实验动物中心）；高速离心机（日立公司）；2.5μL及20.0μL Gilson移液器（吉尔森公司）；24孔板（鼎国生物公司）。本实验在重庆市神经病学重点实验室完成。

1.2 方法

1.2.1 MSs的培养 将人乳腺癌MCF-7细胞接种于含有生长因子的DMEM-F12培养基中，培养基配方包含1∶50B27，20ng／mL EGF，20ng／mL bFGF。在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中进行孵育。每3天换液1次，2 000r／min离心5 min，收集细胞后半量换液及全量换液交替进行。在MSs形成后每5～7天传代1次，传代时2 000r／min离心5min，收集MSs。胰酶消化5min后吹打至MSs消失，从而终止消化，获取微球体细胞（mammospheres-derived cells，MSDCs），离心收集细胞，继续上述无血清培养。

1.2.2 细胞划痕实验 将MSs用胰酶消化成MSDCs，移液器取生长状态良好的MSDCs约30 万个，用适量培养基将其配制成13mL细胞悬液。将MSDCs细胞悬液加入24孔板的中间两排，每孔1mL。24孔板置于37 ℃培养箱过夜。次日观察到细胞开始贴壁后，用移液器沿24孔板中间直线划痕。培养液冲洗掉划下的细胞，加入DMEM-F12无血清培养基，37℃、5%CO2恒温培养箱培养。按第0、24、48小时拍照记录。同时选取MCF-7细胞作为对照（MCF-7组）。

1.2.3 transwell实验 胰酶将MSs消化成单细胞，加入培养基配制成5×106／mL的细胞悬液。transwell上室膜上每孔加入200μL MSDCs悬液，下室每孔加入500μL无血清培养基。培养48h后，取出上室擦去表层细胞，90%乙醇固定30min，自然晾干。结晶紫染色20 min后显微镜下计数细胞通过情况。设MCF-7组为对照。

1.2.4 动物成瘤实验 将MSs消化成单细胞，用培养液稀释为2×103／mL的悬液。1mL注射器（7号针头）将其种植于裸鼠的左侧背部皮下，每只裸鼠注射0.1mL。同时采用2×106／mL MCF-7细胞悬液种植于同一裸鼠的右侧背部作为对照。本组实验共接种6只裸鼠，分别编为Ⅰ～Ⅵ号。接种后动物均放置于动物房内饲养。接种7d后连续观察成瘤情况。1个月后处死动物并取出移植瘤进行石蜡包埋切片及HE染色。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MSs的培养 在无血清悬浮培养第5 天后可以观察到有MSs的形成。在培养第10 天时观察到MSs球体变大，且边缘出现明显的折光带。培养第15天时MSs球体体积停止增长，此时球体结构最为紧密。在将MSs进行传代培养时可以看到，新生成的MSs球体较之前有所变小，且结构较为松散，周围有较多的单个细胞。在传代培养2代后无法形成新的MSs。见图1。

2.2 细胞划痕实验 取对数生长期的MSDCs进行划痕实验。结果发现MSs组细胞迁徙速度较快，在24h后可以看到划痕带处已经有细胞出现，并且划痕带较前变窄。48h后划痕带已愈合，充满大量细胞，且与MSDCs形态一致。MCF-7组在24h后划痕带处未见细胞出现，48h后划痕带未愈合。见图2。

图1 MSs的培养情况（普通光学显微镜×100）

图2 细胞划痕实验照片（普通光学显微镜×40）

2.3 transwell实验 在显微镜下随机选取10个视野，计数出每个视野的细胞个数平均值。MSs 组中可见到（76.24±0.35）个细胞，而MCF-7组中为（17.38±0.18）个（P＜0.05）。MSs具有比MCF-7细胞更强的侵袭能力，见图3。

2.4 动物成瘤实验 在接种第11天时可以观察到Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号裸鼠的右侧背部出现移植瘤，而在接种第18天时观察到仅有Ⅴ号裸鼠的左侧背部出现移植瘤。接种MSs后14d时6只小鼠均可观察到移植瘤的出现且随着时间推移瘤体逐渐增大，在21d后瘤体生长速率加快。而MCF-7组一侧在21d时仅有2组小鼠出现移植瘤，且移植瘤生长速率相对较慢，见图4～5。

图3 细胞侵袭能力检测（transwell×100）

图4 裸鼠成瘤结果

图5 移植瘤生长曲线

3 讨 论

近年来大量的研究证明，肿瘤细胞中有一小部分具有多向分化潜能及自我更新能力的细胞。这与人类造血干细胞的特性相一致，因此有学者将其命名为肿瘤干细胞。其中包括乳腺癌在内的多种实体肿瘤干细胞已经被发现。乳腺癌干细胞的分选培养与证实现已成为众多学者研究的焦点。流式细胞技术磁性激活细胞分选法以及SP 细胞富集分选法已被认为是肿瘤干细胞分选培养的重要手段［1-5］。

CD44＋CD24-与ALDH1＋被认为是乳腺癌干细胞的相关标记物［6］。Phillip等［7］采用无血清悬浮法从人乳腺癌MCF-7细胞中获得了一种可能含有乳腺癌干细胞的乳腺球，其中CD44＋CD24-细胞的比例为40.3%。董华英等［8］利用非黏附性乳腺球悬浮培养法从原代培养的人乳腺癌细胞中得到了具有肿瘤干细胞特性的乳腺癌细胞MSDCs。并且通过流式细胞技术发现所获得的MSDCs中乳腺癌干细胞表面标记物ALDH1＋比例较高，而ALDH1＋与所选病例的化疗次数有关。本实验利用无血清悬浮培养法从MCF-7细胞中获得了MSs，且MSs的培养时间及球体形态与上述学者的研究相符。因此，作者认为无血清悬浮培养法可用于实体肿瘤干细胞的分选培养。

肿瘤细胞所具有的无限增殖与远处侵袭是导致肿瘤临床治疗失败的主要原因。而肿瘤干细胞的特点正是具有极强的侵袭及体外成瘤能力［9-12］。Kim 等［13］在对胰腺胆道腺癌细胞的研究中发现：表达干细胞标记物CD133＋的细胞具有较强的远处迁移及侵袭能力，这类细胞并且具有较强的化疗耐药性。Han等［14］从MCF-7细胞获得了MSs，检测其中N-cadherin、vimentin、a-SMA 等的表达情况后发现MSDCs细胞间质上皮转化活跃。而这种变化可能导致了MSs具有了较强的侵袭能力。动物体内成瘤是检验肿瘤干细胞特性的一项重要手段。Yeh等［15］发现肺癌干细胞具有极强的体外成瘤能力，且移植瘤中高表达干细胞标记物CD44＋及CD133＋。如果加入三氟拉嗪则可抑制其动物致瘤能力。本实验发现MSs在成瘤速度及移植瘤体积方面均强于MCF-7细胞，且HE 染色结果符合肿瘤诊断。因此作者认为MSs在远处迁移、侵袭性生长及动物成瘤方面具有较强的能力，这与肿瘤干细胞的特性相符合。因此推测无血清悬浮培养所获得的MSs具有肿瘤干细胞相关特性，但需要通过下一步实验进行更深入的研究加以证明。

［1］ Kim K，Ihm H，Jy R，et al.High-level expression of stem cell marker CD133in clear cell renal cell carcinoma with favorable prognosis［J］.Oncol Lett，2011，2（6）：1095-1100.

［2］ Kim J，Jung J，Lee SJ，et al.Cancer stem-like cells persist in established cell lines through autocrine activation of EGFR signaling［J］.Oncol Lett，2012，3（3）：607-612.

［3］ Sathi GA，Tamamura R，Tsujigiwa H，et al.Analysis of immunoexpression of common cancer stem cell markers in ameloblastoma［J］.Exp Ther Med，2012，3（3）：397-402.

［4］ Lu X，Deng Q，Li H，et al.Altered characteristics of cancer stem／initiating cells in a breast cancer cell line treated with persistent 5-FU chemotherapy［J］.Exp Ther Med，2011，2（5）：821-826.

［5］ Hashimoto K，Shimizu C，Tsuda H，et al.Immunohistochemical detection of breast cancer stem cells in hormone receptor-positive breast cancer and their role in response to endocrine therapy and clinical outcome［J］.Oncology，2012，82（3）：168-174.

［6］ Yu X，Wang J，Feizpour A，et al.Illuminating the lateral organization of Cell-Surface CD24 and CD44 through plasmon coupling between Au nanoparticle immunolabels［J］.Anal Chem，2013，85（3）：1290-1294.

［7］ Phillip SM，McBride WH，Pajonk F.The response of CD24（-／low）／CD44＋breast cancer-initiating cells to radiation［J］.J Natl Cancer Inst，2006，98（24）：1777-1785.

［8］ 董华英，吴诚义，陈元文.化疗后乳腺癌组织中干细胞微球体的分离，培养及鉴定［J］.吉林大学学报：医学版，2011，37（1）：163-167.

［9］ Jy T，Huang YH，Luo MH，et al.Cancer stem cell markers are associated with adverse biomarker profiles and molecular subtypes of breast cancer［J］. Breast Cancer Res Treat，2012，136（2）：407-417.

［10］ Liu Z，Bandyopadhyay A，Nichols RW，et al.Blockade of autocrine TGF-βsignaling inhibits stem cell phenotype，survival，and metastasis of murine breast cancer cells［J］.J Stem Cell Res Ther，2012，2（1）：1-8.

［11］ Abraha MB，Fritz P，Mcc LM，et al.Preva lence of CD44＋／CD24-／low cells in breast ca ncer May not be associ ated with clinical out come but May favor distant metas tasis［J］.Clin Cancer Res，2009，11（3）：1154-1159.

［12］ Dalla Pozza E，Lerda C，Costanzo C，et al.Targeting gemcitabine containing liposomes to CD44expressing pancreatic adenocarcinoma cells causes an increase in the antitumoral activity［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1828（5）：1396-1404.

［13］ Kim HS，Yoo SY，Kim KT，et al.Expression of the stem cell markers CD133and nestin in pancreatic ductal adenocarcinoma and clinical relevance［J］.Int J Clin Exp Pathol，2012，5（8）：754-761.

［14］ Han M，Liu M，Wang Y，et al.Re-expression of miR-21 contributes to migration and invasion by inducing epithelial-mesenchymal transition consistent with cancer stem cell characteristics in MCF-7cells［J］.Mol Cell Biochem，2012，363（1／2）：427-436.

［15］ Yeh CT，Wu AT，Chang PM，et al.Trifluoperazine，an antipsychotic agent，inhibits cancer stem cell growth and overcomes drug resistance of lung cancer［J］.Am J Respir Crit Care Med，2012，186（11）：1180-1188.