携带鸡贫血病毒凋亡素基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定

邓守明 蔡召忠

携带鸡贫血病毒凋亡素基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定

邓守明 蔡召忠

目的构建携带鸡贫血病毒凋亡素VP3基因的重组腺病毒质粒。方法设计VP3 cDNA扩增引物，从PET15b－VP3质粒中扩增VP3的DNA序列，与线性pShuttle－IRES－hrGFP－2连接，PCR和EcoRⅤ酶切电泳鉴定;穿梭质粒pShuttle－VP3－EGFP经Pmel酶切线性化后，转化含pAdeasy－1的超感受态BJ5183大肠杆菌，细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd－VP3－EGFP，质粒经PCR、PacI酶切电泳及测序鉴定。结果线性化的pShuttle－VP3－EGFP转化含pAdeasy－1的超感受态BJ5183大肠杆菌，重组质粒经酶切获得一大于23 kb的大片段和4．5 kb的片段，PCR反应扩增出了402 bp的片段，重组质粒测序证实VP3－EGFP编码区成功克隆入了腺病毒pAd中，且其序列与GeneBank中VP3 CDNA序列完全一致。结论用细菌内同源重组法可快速、高效地制备携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒质粒，为深入研究VP3的抗肿瘤效应及机制奠定了基础。

同源重组;凋亡素;腺病毒;增强绿色荧光蛋白

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:954～957)

凋亡素(apoptin，VP3)是近年来发现的由鸡贫血病毒基因(CAV)编码产生的蛋白质，具有广谱抗肿瘤特性。研究发现，VP3仅可诱导肿瘤细胞或转化细胞凋亡，而对正常细胞或二倍体细胞不起作用，因此，其被认为是第一个真正意义上可选择性杀伤肿瘤细胞的凋亡蛋白［1－2］。

VP3诱导肿瘤细胞凋亡的能力与其在细胞中的定位密切相关，研究显示，VP3可定位于肿瘤细胞核内，通过磷酸化反应与细胞DNA结合诱导肿瘤细胞凋亡，而在正常细胞中，VP3则定位于细胞质中不能发生磷酸化反应，因此，通过增加VP3的跨膜能力则可增强其诱导肿瘤细胞凋亡的能力，且不会改变其对正常细胞无杀伤的特性［3－4］。

本课题组前期通过构建原核表达载体在大肠杆菌中表达获得的Pep－1－VP3融合蛋白，理论上具有增强VP3蛋白的跨膜能力，然而，由于原核表达存在工程菌表达量低，表达产物有包涵体需变性复性，以及分离和纯化蛋白技术受限等原因，使得制备的产物在后续的细胞实验中结果并不令人满意［5］。为解决以上难题，笔者选用腺病毒做为载体，通过细菌内同源重组法构建携带VP3基因的重组腺病毒质粒以期对VP3功能做进一步深入研究，现将制备过程报告如下。

1 材料与方法

1．1 材料

重组质粒PET15b－VP3、含腺病毒骨架质粒pAdeasy－1的超感受态菌BJ5183、腺病毒穿梭质粒pShuttle－IRES－hrGFP－2和XL10－Gold、DH5α、DNA ladder、dNTP、pfuDNA聚合酶，EcoRⅤ、Pmel、PacI、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)、细菌培养用胰蛋白胨和酵母提取物均由湖北医药学院临床医学研究所提供;其余生化试剂均为国产或进口分析纯。PCR仪(Biometra，德国)、超速冷冻离心机(HCP80MX日本)、凝胶图像分析系统(Touching 995gel document system，上海)、恒温水浴摇床(SHY－2，江苏)。

1．2 方法

1．2．1 目的基因VP3获得以1 μL重组质粒PET15b－VP3为模板，20 mmol/L的上下游引物各10 μL，10×buffer10 μL，50×dNTP2 μL，pfuDNA聚合酶1 μL加蒸馏水至总反应体积65 μL。VP3－cDNA扩增引物:上游引物P1:5’－GCTAGCACTAGTGATATCATGAACGCTCTCCAAGAA3－’;下游引物P2:5’－GTCGACCGATCGGATATCTTACAGTCTTATACGCCT－3’，划线部分为EcoRⅤ酶切位点，斜体部分与线性化穿梭质粒pShuttle－IRES－hrGFP－2切口两端序列同源，以便靶向同源重组，扩增产物402 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应条件:预变性95℃3 min，变性95℃30 s，退火68℃1 min，延伸68℃30 s，35次循环，最后72℃延伸10 min。1．5%普通琼脂糖凝胶电泳鉴定获得PCR产物，0．8%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收402 bpVP3目的基因片段。

1．2．2 pShuttle－VP3－EGFP重组穿梭质粒的构建及鉴定将EcoRⅤ酶切线性化的穿梭质粒pShuttle－IRES－hrGFP－2和目的基因VP3采用PCR产物定向同源重组方式连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，取单克隆菌落进行PCR鉴定，PCR反应体系共50 μL如下:10×buffer 5 μL，50×dNTP(10 mmol/L)1 μL，10×上游引物P1 5 μL，10×下游引物P2 5 μL，pfuDNA聚合酶1 μL，含重组质粒的菌落1 μL、加去离子水至50 μL，鉴定正确后大量培养细菌，抽提质粒DNA并进行EcoRⅤ酶切电泳鉴定。

1．2．3 pAd－VP3－EGFP重组腺病毒质粒的构建及鉴定取上述鉴定正确的pShuttle－VP3－EGFP重组穿梭质粒经PmeI酶切24 h后，直接用3 mol/LNaAc和无水乙醇沉淀DNA，70%的乙醇漂洗沉淀，离心后弃上清，用牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)37℃恒温水浴箱中温育1 h后在50℃恒温烤箱上去磷酸化2 h，经酚、氯仿抽提后转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy－1的超感受态大肠杆菌BJ5183，次日挑取2个单克隆菌落，小量培养，碱裂解法小量提取质粒，经PacI酶切，0．8%琼脂糖凝胶电泳，若出现一大于23 kb和45 kb或30 kb的特征性条带，即为阳性质粒，将重组的pAd－VP3－EGFP在XL10－Gold中大量扩增并抽提质粒，送上海生工生物工程技术有限公司进行DNA测序。

2 结果

2．1 目的基因VP3的获得

以PET15b－VP3为模板，根据VP3上下游引物PCR扩增后，1．5%普通琼脂糖凝胶电泳可见特征性402bpVP3基因扩增片断(图1)。

图1 VP3目的基因的PCR扩增

2．2 pShuttle－VP3－EGFP重组穿梭质粒的构建及鉴定

扩增产物VP3cDNA含EcoRⅤ酶切位点，且末端序列与线性化pShuttle－IRES－hrGFP－2相同，与经EcoRⅤ酶切后的线性化穿梭质粒pShuttle－IRES－hrGFP－2混合，在同源重组酶作用下可发生同源重组，形成穿梭质粒pShuttle－VP3－EGFP，将穿梭质粒转化感受态大肠杆

菌DH5α，取转化菌液在含卡那霉素的TB琼脂糖上铺板，次日分别取多个单克隆菌落进行PCR扩增后经1．5%琼脂糖凝胶电泳可见到特征性的402 bp条带(图2)，将鉴定阳性的克隆菌落大量培养，抽提质粒DNA经EcoRⅤ酶切后电泳获得8．9 kb和402 bp 2条带(图3)，证明目的基因VP3已成功插入到穿梭质粒pShuttle－IRES－hrGFP－2中。

图2 pShuttle－VP3－EGFP重组穿梭质粒VP3基因扩增

图3 pShuttle－VP3－EGFP重组穿梭质粒EcoRⅤ酶切电泳

2．3 pAd－VP3－EGFP重组腺病毒质粒的构建及鉴定

pShuttle－VP3－EGFP转化含pAdeasy－1的超感受态大肠杆菌BJ5183后，含有重组质粒的细菌可在含卡那霉素的培养基中生长形成克隆菌落，挑取转化克隆菌落，小量提取质粒DNA，用PacI酶切重组腺病毒质粒出现一大于23 kb和45 kb的片段(图4)，说明pAdeasy－1与pShuttle－VP3－EGFP在复制起始位点与右臂之间发生了同源重组。pAd－VP3－EGFP中的目的质粒基因测序结果显示与GeneBank报道的CAV中的VP3 CDNA序列相一致，证明VP3目的基因已经成功插入到骨架质粒pAdeasy－1中。

图4 pAd－VP3－EGFP重组腺病毒质粒PacI酶切电泳

3 讨论

腺病毒既可以感染分裂期细胞，也可感染增殖期细胞，且可在感染的细胞内获得高效的基因表达，具有转染率高和靶向性好等优点，是当前构建真核表达质粒最常用的运载工具［6－7］。本文中，我们采用基因工程手段构建携带目的基因VP3的重组腺病毒质粒，为后续进一步研究VP3蛋白的核定位及抗肿瘤效应并探讨机制奠定基础。

本研究首先通过设计5‘端带有pShuttle－IRES－hrGFP－2穿梭质粒EcoRⅤ酶切线性化末端18个碱基的上下游引物对VP3目的基因进行扩增，使扩增产物与EcoRⅤ酶切后的线性化pShuttle－IRES－hrGFP－2具有相同的粘性末端，在同源重组酶的催化下易发生同源重组，然后用腺病毒骨架质粒转化感受态大肠杆菌BJ5183，再用PmeI线性化携带目的基因的重组穿梭质粒pShuttle－VP3－EGFP，转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy－1的超感受态大肠杆菌BJ5183，制备pAd－VP3－EGFP，通过抗性基因初筛，再经PCR和质粒抽提酶切及测序等方法对构建的重组质粒做进一步鉴定。上述两次同源重组过程均在细菌内进行，与以往在细胞内进行同源重组相比较，具有明显的优势，一是重组效率高，由于细菌繁殖能力强，对周围环境要求不高，且同源重组能力强，故可大大提高重组的成功率。二是由于细菌内质粒抽提、酶切及PCR扩增等技术均较在哺乳动物细胞内进行DNA操作更加简单易行，故使得整个操作过程更加简便快捷［8］。

本研究中还使用了XL10－Gold，因其具有RecA和EndA1缺陷，可确保成功重组的腺病毒质粒pAd－VP3－EGFP在其内扩增时可大大提高提取质粒的质量和插入外源基因VP3的稳定性。下一步拟将pAd－VP3－EGFP重组质粒经PacI酶切线性化后，通过脂质体法转染入Ad293细胞内包装成重组腺病毒，通过在荧光显

微镜下观察293细胞内有无绿色荧光蛋白表达来判断质粒是否转染成功，取第一代病毒上清再转染293细胞，如果细胞内出现了绿色荧光，即说明包装的重组腺病毒具有一定的感染性，然后，依上述方法取第二代上清重复感染293细胞，即可获得高滴度的重组腺病毒，将其感染肿瘤细胞，即可对其抗肿瘤效应及作用机制探讨等进行后续研究。

［1］Backendorf C，Visser AE，de Boer AG，et al．Apoptin:therapeutic potential of an early sensor of carcinogenic transformation〔J〕．Annu Rev Pharmacol Toxicol，2008，48(2): 143－163．

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Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Plasmid Containing Apoptin VP3 Gene

DENG Shouming，CAI Zhaozhong．China MCC5 Group Corp．ltd Hospital，Chengdu，610081

ObjectiveTo construct recombinant adenovirus plasmid containing apoptin VP3 gene．MethodsThe VP3 cDNA primers were designed，the DNA sequence of VP3 was amplified from recombinant vector PET15b－VP3 and ligated into pShuttle－IRES－hrGFP－2，the recombinant plasmid was named after pShuttle－VP3－EGFP and was identified with PCR and EcoRⅤdigestion;pShuttle－VP3－EGFP was linealized with PmeI and transformed into ultracompletent BJ5183 containing pAdeasy－1，then recombinant adenovirus pAd－vp3－EGFP was constructed by homologous recombination in bacteria．The recombinant adenoviral plasmid pAd－VP3－EGFP was identified by PCR，PacI digestion and DNA sequencing．ResultsThere were 2 bands 4．5 kb and larger than 23 kb when pAd－VP3－EGFP was digested with PacI．A 402 bp VP3 cDNA fragment was amplified by PCR．The target gene VP3－EGFP was successfully cloned into adenovirus，The sequence of VP3 segment was identical with that published in Gen－Bank．ConclusionHomologous recombination in bacteria can efficiently and conveniently construct high quality recombinant adenovirus containing VP3 and enhanced green fluorescent protein gene，which provides a basis for VP3 further research in cancer therapy．

Homologous recombination;Apoptin;Adenovirus;Enhanced green fluorescent protein(EGFP)

10．3969/j．issn．1001－5930．2015．07．002

R73－36

:A

:1001－5930(2015)07－0954－04

2014－10－16

2015－03－06)

(编辑:吴小红)

湖北省教育厅基金(B20122413);湖北省卫生厅基金(QJX2008－42)

610081中国五冶集团有限公司医院(邓守明);442000湖北医药学院附属东风医院(蔡召忠)

蔡召忠