通心络胶囊对糖尿病小鼠视网膜p38MAPK信号通路的影响

张哲王超

通心络胶囊对糖尿病小鼠视网膜p38MAPK信号通路的影响

张哲王超

【摘要】目的观察通心络胶囊对糖尿病小鼠视网膜p38丝裂原活化蛋白激酶( p38MAPK)信号通路的影响，探讨其视网膜保护作用的可能机制。方法KK/Upj-Ay小鼠40只随机分为糖尿病模型组、通心络低、中、高剂量组，每组10只，另设C57BL/6( C57)小鼠10只作为对照组。按照分组给予不同剂量处理因素，疗程3个月，观察体质量，测定空腹血糖( FBG)，取眼球行HE染色，Western-blot检测视网膜p38MAPK、JNK、ERK总蛋白及磷酸化p38MAPK、JNK、ERK( p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK)的表达。结果与对照组比较，模型组体质量、FBG及p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK表达均显著增高，通心络胶囊能够减轻视网膜病理损伤，降低p-p38MAPK表达( P＜0．05)，而不影响体质量、FBG及p-JNK、p-ERK表达( P＞0．05) ;且各组p38MAPK、JNK、ERK总蛋白表达差异无统计学意义( P＞0．05)。结论p38MAPK信号通路可能参与了糖尿病视网膜损害的发生发展。通心络胶囊可减轻糖尿病小鼠视网膜病理损伤，其机制可能与降低p38MAPK蛋白磷酸化水平有关。

【关键词】通心络胶囊;糖尿病;视网膜; p38丝裂原活化蛋白激酶

糖尿病视网膜病变( diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常见且严重的眼部并发症，是造成患者失明的主要原因［1］。研究发现，p38丝裂原活化蛋白激酶( p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)信号通路的活化参与了糖尿病脂肪、骨骼肌组织的胰岛素抵抗，并与糖尿病肾病的发生密切相关［2，3］，但p38MAPK是否参与DR病理过程目前尚不清楚。基础和临床研究均证实，通心络胶囊通过抑制血小板聚集和黏附、保护血管内皮功能等作用减轻DR［4］。本实验采用自发性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠为模型，通过观察通心络胶囊对p38MAPK信号通路的影响，旨在探讨通心络胶囊对DR的保护作用及其可能机制。

1　材料与方法

1．1材料通心络胶囊购自石家庄以岭药业股份有限公司; p38丝裂原活化蛋白激酶( p38MAPK)、磷酸化p38MAPK ( p-p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶

( JNK)、磷酸化JNK( p-JNK)、细胞外信号调节蛋白激酶( ERK)、磷酸化ERK( p-ERK)一抗购自美国Sigma公司; BCA蛋白检测试剂盒及ECL化学发光试剂盒购自北京天根公司。

1．2方法

1．2.1实验动物、分组及给药:选取12周龄SPF级KK/Upj-Ay和C57BL/6小鼠，雄性，体质量分别为30 ～40 g和25～30 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，20～25℃常规饲养。按空腹血糖值( FBG)将40只KK/Upj-Ay小鼠分为4组:糖尿病模型组、通心络胶囊低剂( 1 g生药/kg)、中剂( 2 g生药/kg)、高剂( 4 g生药/kg)组，另设C57BL/6小鼠10只为对照组，对照组和模型组给予等体积蒸馏水，每天1次灌胃给药，疗程3个月。每周测量并记录各组体质量、FBG。

1．2．2 HE染色:取小鼠眼球，置于甲醛固定，石蜡包埋、切片，HE染色。高倍镜下观察视网膜细胞形态结构。

1．2．3Western-blot:取视网膜组织，常规方法提取总蛋白，化学发光法显色，用UVP软件检测并分析蛋白条带IOD值，β-actin作为内参照，以目的蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行定量分析。

1．3统计学分析应用SPSS 10．0统计软件，计量资料以珋x±s表示，采用t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2　结果

2．1通心络胶囊对DR小鼠体重及FBG的影响模型组体重、FBG均较对照组明显增高( P＜0．01)，通心络组体重、FBG与模型组比较有下降趋势，但差异无统计学意义( P＞0．05)。见表1、2。

表1　通心络胶囊对DR小鼠体重的影响

表2　通心络胶囊对DR小鼠FBG的影响

2．2通心络胶囊对DR小鼠视网膜组织病理形态的影响HE染色结果显示:对照组视网膜组织结构完整，细胞分层清晰，排列紧密整齐;模型组视网膜细胞层明显变薄，细胞排列紊乱，通心络中、高剂组细胞形态结构较模型组明显改善。

2．3通心络胶囊对DR小鼠视网膜MAPK信号通路的影响Western-blot结果显示:模型组p38MAPK、JNK、ERK蛋白磷酸化水平均较对照组明显升高( P ＜0．05或0．01)，通心络中、高剂组p38MAPK蛋白磷酸化水平较模型组明显降低( P＜0．05)，JNK和ERK蛋白磷酸化水平与模型组比较差异无统计学意义( P ＞0．05) ; 5组p38MAPK、JNK、ERK总蛋白表达比较差异无统计学意义( P＞0．05)。见表3、图1。

表3　通心络胶囊对DR小鼠视网膜MAPK信号通路的影响　n =10，珋x±s

3　讨论

DR是糖尿病的严重并发症之一，有关DR的发病机制受到越来越多学者的普遍关注。近年来多项证据表明MAPK信号通路在糖尿病的发生发展中发挥重要调控作用［3］，然而MAPK在DR小鼠视网膜中的研究国内外报道尚少。MAPK是广泛存在于哺乳动物细胞浆内的丝/苏氨酸蛋白调节激酶，该通路是介导细胞内外信号传递的主要通路，在细胞增殖、分化、凋亡及基因表达过程中发挥着关键的调控作用。在MAPK家族中，p38 MAPK、JNK、ERK是其中的主要成员，前两者可在高糖、氧化应激、炎症因子等刺激下活化，后者主要调控丝裂原诱导的细胞生长。

图1　Western-blot检测p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK的表达

近年来，许多动物模型及高糖刺激下的体外细胞模型研究均发现p38 MAPK的磷酸化水平显著增加。国内外研究显示，p38 MAPK信号通路的活化是糖尿病神经痛、心肌病、肾病等糖尿病慢性并发症的共同通路，而磷酸化p38 MAPK( p-p38MAPK)是该通路中发挥关键作用的信号分子［3，4］。Lee等［5］研究发现p38 MAPK、晚期糖基化终末产物( RAGE)、白细胞、醛糖还原酶参与了糖尿病导致的视网膜血管功能损伤。Huang等［6］研究了p38 MAPK、JNK、ERK及p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK在2型糖尿病模型小鼠肠系膜动脉内皮细胞中的表达，结果显示各组间p38 MAPK、JNK、ERK蛋白表达水平无变化，然而p-p38 MAPK、p-JNK表达在糖尿病组明显升高，p-ERK表达明显降低，提示磷酸化p38 MAPK、JNK、ERK表达的改变参与了糖尿病导致的血管内皮功能失调。Zhang等［7］研究发现在糖尿病模型组视网膜中p38 MAPK总蛋白表达与正常对照组无明显差异，但p-p38 MAPK表达水平显著增高。由此，有理由怀疑p38 MAPK信号通路与DR之间存在某种关联。本实验中，我们探讨了p38 MAPK信号通路对DR小鼠视网膜功能的影响，Western-blot结果发现: p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK蛋白表达在模型组较对照组明显增加( P＜0．05)，而p38 MAPK、JNK、ERK总蛋白表达在各组间无显著变化，提示p38 MAPK信号通路在糖尿病小鼠视网膜组织活化明显，磷酸化的p38 MAPK、JNK、ERK参与了自发性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠视网膜病变的发生发展，以上述通路为切入点有可能减轻或改善DR。

通心络胶囊是包含人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鳖虫，蝉蜕、赤芍等成分的中药复方制剂。基础和临床研究均证实，通心络胶囊具有降脂、降糖、抗凝、改善微循环和胰岛素抵抗的作用，其治疗糖尿病微血管病变的疗效确切。然而通心络胶囊是否对DR具有保护作用及其可能作用机制尚未完全明确。本研究发现，通心络中、高剂组能够明显降低DR小鼠视网膜病理损伤，改善视网膜病变，从形态学角度证实通心络胶囊确实具有明显的DR保护作用，但对体重及FBG无明显影响。为了进一步探讨通心络胶囊改善糖尿病小鼠视网膜损伤的机制，我们检测了通心络干预组p38 MAPK、JNK、ERK在视网膜的表达。我们研究发现通心络中﹑高剂组干预后p38 MAPK的磷酸化程度明显下降，而JNK、ERK的磷酸化程度不受影响。长期高糖刺激能够促进细胞内抗链激酶1及其他链激酶的激活，后者通过磷酸化p38 MAPK激酶3 ( MKK3)和p38 MAPK激酶6 ( MKK6)导致p38 MAPK三肽区的苏/酪氨酸被双磷酸化而激活，活化的p38 MAPK移位进入细胞核后能够促使NF-κB、AP-1等转录因子的核转位从而导致一氧化氮( NO)、环氧化酶2( COX-2)、内皮素1( ET-1)、黏附分子及自由基的产生增加，通过诱导细胞凋亡和加重炎性反应导致DR的形成和持续发展。因此，通过干预p38 MAPK信号通路中的关键信号分子p-p38 MAPK表达就有可能抑制p38 MAPK信号通路的活化。研究显示，高糖诱导视网膜内皮细胞中氧化应激增加，通过激活内皮细胞VEGF/p38 MAPK通路最终导致细胞凋亡的增加，而钙拮抗剂和血管紧张素可通过抑制p38 MAPK及抗氧化作用减轻细胞凋亡，从而发挥DR保护作用。我们和他人研究从体内动物模型及体外培养的细胞模型等多个角度证实了磷酸化p38 MAPK的过表达是糖尿病及其并发症发生发展的关键环节，抑制磷酸化p38 MAPK或其下游分子的表达，可为治疗DR提供新的思路。芪黄明目胶囊对DR模型小鼠视网膜损伤具有保护作用。芪黄明目胶囊可改善DR模型小鼠视网膜功能，抑制视网膜组织p38 MAPK磷酸化水平，但是，对总p38 MAPK及血糖无明显影响。本研究结果显示通心络胶囊DR保护作用的潜在机制可能与抑制磷酸化p38 MAPK表达及其信号转导通路有关，与上述研究结果一致。我们和他人研究结果均提示了p38 MAPK作为细胞信号传递的共同通路可能是糖尿病慢性并发症治疗的潜在靶点，采用中药或特异性拮抗剂阻止p38 MAPK信号通路激活或抑制p38 MAPK活性有可能成为改善糖尿病肾病、心肌病及视网膜病变的有效措施，但p38 MAPK介导糖尿病视网膜损伤发生的具体信号机制有待进一步研究。

目前很多研究证实长期高糖状态下p38 MAPK信号通路可被体内氧化应激等多种刺激激活，后者介导的凋亡信号传导直接参与DR的发生发展。通心络胶囊干预后能够降低磷酸化p38 MAPK的表达，改善视网膜功能，延缓DR进展。本研究虽然为DR的治疗和新药研发提供新思路，但要想彻底治愈这种疾病，我

们还需要从疾病发生的信号通路方面进行更广泛更深入的研究。

参考文献

1Zeng J，Chen B．Epigenetic Mechanisms in the Pathogenesis of Diabetic Retinopathy．Ophthalmologica，2014，41: 196-201．

2Tzeng TF，Liou SS，Chang CJ，et al．The ethanol extract of Lonicera japonica ( Japanese honeysuckle) attenuates diabetic nephropathy by inhibiting p38 MAPK activity in streptozotocin-induced diabetic rats．Planta Med，2014，80: 121-129．

3Jiao P，Feng B，Li Y，et al．Hepatic ERK activity plays a role in energy metabolism．Mol Cell Endocrinol，2013，375: 157-166．

4孟宪民，张书申，段永畅．通心络胶囊联合激光治疗糖尿病性视网膜病变的观察．医药论坛杂志，2011，32: 155-156．

5Lee CA，Li G，Patel MD，et al．Diabetes-induced impairment in visual function in mice: contributions of p38 MAPK，RAGE，leukocytes，and aldose reductase．Invest Ophthalmol Vis Sci，2013，56: 271-277．

6Huang A，Yang YM，Yan C，et al．Altered MAPK signaling in progressive deterioration of endothelial function in diabetic mice．Diabetes，2012，61: 3181-3188．

7Zhang X，Lai D，Bao S，et al．Triamcinolone acetonide inhibits p38MAPK activation and neuronal apoptosis in early diabetic retinopathy．Curr Mol Med，2013，13: 946-958．

·论著·

项目来源:河北省自然科学基金项目(编号: C2011307008)

作者单位: 050051石家庄市，河北省人民医院省老年医学重点实验室

Effects of Tongxinluo capsule on p38 mitogen-activated protein kinase signal pathway in retina of diabetic mice

ZHANG Zhe，WANG Chao．Key Laboratory of Geriatric Medicine，Hebei Provincial People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China

【Abstract】Objective To observe the effects of Tongxinluo capsule on p38 mitogen-activated protein kinase ( p38MAPK) signal pathway in retina of diabetic mice in order to explore the possible mechanism of the protective effect of Tongxinluo capsule on retina．Methods Forty KK/Upj-Ay mice were randomly divided into diabetes model group，diabetic model with Tongxinluo ( low-dose，median-dose，high-dose) groups，with 10 mice in each group，at the same time，10 C57BL/6 mice were selected as control group．After 3 months，the mice were sacrificed and were weighed．The fasting blood glucose ( FBG) was measured．The retina was subjected to HE staining．The expression levels of total p38MAPK，phosphorylated p38MAPK( p-p38MAPK)，total JNK，phosphorylated JNK( p-JNK)，total ERK，phosphorylated ERK( p-ERK) in retina were detected by Western blotting．Results As compared with those in control group，the average body mass and the expression levels of p-p38MAPK，p-JNK，p-ERK were significantly increased in model group．Tongxinluo capsule could relieve retinal pathological damage and reduce the expression levels of p-p38MAPK in retina of diabetic mice ( P＜0．05)，however，which had no effect on body weight，FBG and expression levels of p-JNK，p-ERK( P＞0．05)．Furthermore，there were no significant differences in the expression levels of p38MAPK，JNK and ERK proteins among groups ( P＞0．05)．Conclusion The p38MAPK signal pathway may be involved in the pathogenesis and development of diabetic retina injury．Tongxinluo capsule can relieve retina pathological damage in diabetic mice，which may be related with down-regulating phosphorylation of p38MAPK protein．

【Key words】Tongxinluo capsule; diabetes mellitus; retina; p38 mitogen-activated protein kinase

收稿日期:( 2014－09－03)

通讯作者:王超，050051河北省人民医院省老年医学重点实验室;E-mail: 13731156811@163．com

doi:10．3969/j．issn．1002－7386．2015．04．007

【中图分类号】R 587．26

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386( 2015) 04－0504－04