心肌缺血对大鼠肾皮质利钠肽受体表达的影响

牛丽静　白云　苗智慧　宋俊贞　管振龙　王燕凌　王惠娟

心肌缺血对大鼠肾皮质利钠肽受体表达的影响

牛丽静白云苗智慧宋俊贞管振龙王燕凌王惠娟

【摘要】目的探讨大鼠肾皮质利钠肽受体A( NPR-A)和受体C( NPR-C)的表达在心肌缺血后不同时程的动态变化。方法大鼠分为空白对照组、假手术组和模型组。分别于复制心肌缺血模型后的第3、7、14、18、28天取材，用Western blotting方法检测肾皮质内NPR-A和NPR-C的表达。结果在上述时间点上，肾皮质NPR-A的表达显著性降低( P＜0．01)，NPR-C表达呈现由缺血后第3天到缺血后第18天由低到高的波动变化，到缺血后第28天逐渐恢复至空白对照组水平。结论心肌缺血后，动物机体钠和水的滞留与NPR-A表达的降低以及NPR-C表达的升高密切相关。

【关键词】心肌缺血;利钠肽受体;肾皮质;蛋白质印迹;大鼠

利钠肽受体( NPR)主要分为具有鸟苷酸环化酶活性的NPR-A( natriuretic peptide receptors A)、NPR-B ( natriuretic peptide receptors B)以及与抑制性G蛋白偶联并可以从循环中清除利钠肽的受体NPR-C( natri-

uretic peptide receptors C)。研究发现，在肾脏集合管上皮细胞基侧膜、肾小球以及肾小球膜细胞上分布有利钠肽受体，利钠肽在肾功能的调节中起重要作用，通过舒张血管以及利钠利尿的作用对抗肾素-血管紧张素系统［1］。心肌缺血后肾脏功能受损［2］，即便血浆中存在显著升高的利钠肽，但是仍然不能改变机体内钠和水的滞留现象。由此，作者推测可能心肌缺血后，肾脏组织存在严重的利钠肽功能不足，但目前尚无详细报道。本实验以大鼠心肌缺血模型，应用Western blotting技术检测NPR-A、NPR-C缺血后不同时间点在肾皮质的表达变化，以期找到其在心肌缺血后肾皮质上的时程变化规律，为探究心肌缺血后肾脏功能的变化机制提供基础资料。

1　材料与方法

1．1材料与试剂健康雄性SD大鼠(体重280～330 g，由河北医科大学试验动物中心提供) 60只，购入后在实验室常温饲养48 h，适应实验室环境后用于实验。兔抗NPR-A多克隆抗体( abcom)、兔抗NPR-C多克隆抗体( abcom)。

1．2实验分组及模型复制大鼠随机分为实验组(模型组，43只)，实验对照组(假手术组，8只)、空白对照组( 9只)。实验组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠( 40 mg/kg)麻醉后，在第4～5肋骨间开胸，暴露心脏，用6-0号缝合线迅速结扎心脏的冠状动脉左前降支复制心肌缺血动物模型［3］。大鼠手术后进行恢复性饲养。将成活的实验组大鼠随机分为术后第3天取材组( 9只)，术后第7天取材组( 7只)，术后第14天取材组( 9只)，术后第18天取材组( 9只)和术后第28天取材组( 9只)。假手术组大鼠除了不结扎冠状动脉左前降支外，其他手术与实验组的处理相同。空白对照组大鼠不做手术处理，正常饲养。

1．3取材实验组动物分别在手术后的第3天( 9 只)、7天( 7只)、14天( 9只)、18天( 9只)和28天( 9 只)深度麻醉( 80 mg/kg)，剪开胸腔，暴露心脏，经升主动脉插管，先用100 ml 0．9%氯化钠溶液冲洗血液。血液冲洗干净后，迅速摘下心脏，用吸水纸吸干多余水分后称重;剖开腹腔摘取双侧肾脏，左侧肾脏摘下后于冷的0．9%氯化钠溶液中，用手术刀片纵切剖开肾脏后，迅速剥离肾皮质，用吸水纸吸干多余水分后保存于低温环境( 0～4℃)，备用(约0．2 g) ;右侧肾脏用吸水纸吸干过多水分后称重。假手术组大鼠、空白对照组大鼠于实验组术后第3天按上述方法进行取材处理。

1．4TTC染色从上述取材过程中摘下的心脏的心尖部注入1 ml 3%的伊万氏蓝。数秒后将心脏在4℃ 0．9%氯化钠溶液中冲洗，滤纸吸干水后－20℃保存30 min。随后把冷冻后的心脏沿房室沟轴横切成2．0 ～2．5 mm厚的断面，用0．1%的TTC 0．9%氯化钠溶液溶液37℃孵育30 min。正常组织被染成红棕色，梗死区不着色，以此判定心肌缺血模型是否复制成功［4］。

1．5蛋白质印迹分析取大鼠肾脏皮质部分，分别将实验组、实验对照组以及空白对照组大鼠( R = 3～4 只)处理并备用的组织混合，低温下加入RIPA裂解液研磨成浆液，离心后取上清液，考马斯亮蓝蛋白定量。按照蛋白标准曲线测定组织上清液中的蛋白含量，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(每加样孔中蛋白上样量60 μg)之后，将凝胶进行转膜，并进行NPR-A 和NPR-C的免疫印迹杂交(抗体稀释浓度为1∶500)以内参肌动蛋白(β-actin)条带光密度值作为标准，计算NPR-A和NPR-C蛋白的相对表达量。

1．6统计学分析应用SPSS 13．0统计软件，计量资料以珋x±s表示，进行单因素方差分析，Student Newman-Keuls检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2　结果

2．1TTC染色结果模型动物心脏深染成蓝色，冠脉结扎创口附近有非常明显的红色缺血区和灰白色梗死区。假手术组动物心肌可见少量红色区域。空白对照组动物心肌组织未见红色缺血区及白色梗死区域。所有大鼠心肌缺血模型复制成功。见图1。

2．2心肌缺血后大鼠心脏和肾脏重量的变化大鼠经冠状动脉左前降支结扎复制心肌缺血模型后，随时间延长心脏明显肥大，重量逐渐升高，在术后第14天、18天、28天与空白对照组及假手术组比较差异有统计学意义( P＜0．05)。手术后肾脏的重量，同样出现随时间先升高后下降的趋势，但无统计学意义( P＞0．05)。大鼠心肾重量假手术组与空白对照组均无显著变化( P＞0．05)。这些指标符合实验预期的要求。见表1、2，图2。

表1　大鼠心脏在结扎手术后的平均重量　g，珋x±s

表2　大鼠肾脏在结扎手术后的平均重量　g，珋x±s

2．3肾皮质Western blotting结果对心肌梗死后大鼠肾皮质的Western blotting检测结果，如图3所示。以β-actin( 42 kD)作为内参，NPR-A在相对分子量118 kD处有明显的阳性条带，NPR-C在相对分子量

65 kD处有明显的阳性条带。心肌梗死后NPR-A的表达显著降低，其中，手术后第7天、18天、28天显著低于空白对照组( P＜0．01)。NPR-C的表达由手术后3天显著低于空白对照组( P＜0．01)，而后逐渐升高，到手术后第18天显著高于空白对照组( P＜0．01)，以及到第28天NPR-C的表达已经恢复到与空白对照组无显著差异( P＞0．05)。见表3、4，图3。

图1　TTC染色结果( A) B的示意图; ( B)心肌梗死区域被染成亮蓝色，心肌缺血区域被染成红色，非缺血区域被染成灰白色

图2　大鼠心脏和肾脏在结扎手术后的平均重量( g)

表3肾皮质内NPR-A蛋白表达水平在结扎手术后的平均灰度值

表4　肾皮质内NPR-C蛋白表达水平在结扎手术后的平均灰度值

3　讨论

大量的基础和临床实验研究表明，心肌缺血后由于心肌收缩无力，心脏内积存的血液过多，对室壁压力的增加诱导了利钠肽大量的分泌，其中脑钠肽的分泌量与心肌病变的程度呈正相关［5］。所以，临床上已将血液中脑钠肽的变化作为评估冠心病的重要指标。心脏分泌的利钠肽可能通过无血脑屏障的部位入脑，作用于不同的中枢部位，通过影响激素的分泌和交感、副交感神经的活动参与心血管功能的调节［6］。另一方面可以通过抑制肾上腺醛固酮的分泌，降低肾小管细胞的代谢活动，促进排钠排水，降低血压和回心血量，减少心脏内的血液积存。

利钠肽激活细胞膜上的NPR－A或NPR－B对抗交感神经紧张，以及肾素－血管紧张素系统，促进水钠的排泄［7］。研究发现，大鼠心肌梗塞后，血浆利钠肽浓度显著升高［8］，肾素浓度显著升高，肾脏血流量减少［9］。给正常大鼠灌流利钠肽，可以显著降低心输出量，右心房、左心室末端舒张压，动脉血压并增加心率，相对的增加肾脏血流量，增加尿量、尿钠的分泌，肾小球率过滤等［10］;但给心肌缺血大鼠灌流利钠肽却没有上述肾脏血流动力学的变化［11］。发生心肌梗死的大鼠即便血浆中具有高浓度的利钠肽，仍然存在机体钠和水的滞留。心肌缺血后，机体血压的变化是个复杂的病例生理过程，而肾脏在动脉血压的长期调控中起重要作用，在肾脏集合管上皮细胞膜基侧膜、肾小球以及肾小球膜细胞上分布有利钠肽受体。

图3　冠脉结扎后大鼠肾皮质NPR-A和NPR-C的表达变化

本实验结合前人的实验结果［12，13］，以SD大鼠为实验对象，复制心肌缺血模型，观察肾脏皮质内NPRA和NPR-C在心肌缺血后第3天、7天、14天、18天、28天的表达变化，结果发现，在心肌缺血后的第7天、18天、28天，大鼠肾脏皮质区的NPR-A显著低于空白对照组( P＜0．01)，肾皮质的NPR-C在心肌缺血后第3天显著低于空白对照组( P＜0．01)，而后逐渐上升，至心肌缺血后第18天显著高于空白对照组( P＜0．01)，至缺血后第28天，与空白对照组无显著差异。NPR-A的显著降低以及清除剂型受体NPR-C的逐渐

升高显著的减弱了血浆中高浓度的利钠肽对出球小动脉以及入球小动脉的舒张作用，从而降低了肾血浆流量和肾小球滤过率，进而抑制了钠和水的排泄。所以即便给予心肌缺血大鼠灌流利钠肽，仍然不能改善降低的肾小球滤过率和肾血浆流量［14，15］。Tsunoda等［12］的研究发现，心肌梗死4周后，大鼠肾脏内髓部分利钠肽结合位点减少1/3。这表明分布于肾髓质集合管上皮细胞基侧膜上的利钠肽受体数量减少，生成的细胞内cGMP含量降低，不能关闭管腔膜上的Na+通道，从而增加了NaCl的重吸收，造成钠和水的滞留。

本实验首次细致的研究了心肌缺血后肾脏皮质利钠肽受体NPR-A和NPR-C的动态表达变化趋势，提出了心肌缺血后机体水钠滞留的可能原因。大鼠心肌缺血后，血液中利钠肽含量显著升高，血浆脑钠肽浓度在第3天和第14天有2次升高［16］，即便血浆中存在高浓度的利钠肽水平，但是肾脏的排钠排水功能由于利钠肽功能型受体的显著降低而受到损害。血浆中升高的利钠肽通过抑制肾上腺醛固酮的分泌，降低肾小管细胞的代谢活动，促进排钠排水，降低血压和回心血量，减少心脏内的血液积存［17］。肾脏利钠肽受体NPR-A的显著降低以及NPR-C的波动性升高，可能也只是为了升高血浆中的利钠肽水平，从而更好的调控心肌缺血后的动脉血压。心肌缺血后，如何在利钠肽参与机体血压调控的同时，又不影响肾脏的排钠排水功能，将是我们今后的研究重点。

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·论著·

项目来源:河北省医学科学研究重点课题(编号: 20090044)

作者单位: 050021石家庄市，河北省疾病预防控制中心医学研究所(牛丽静、苗智慧、王燕凌、王惠娟) ;河北省唐山职业技术学院基础医学部解剖教研室(白云) ;河北省血液中心临床输血技术指导办公室(宋俊贞) ;河北师范大学生命科学学院(管振龙)

Effect of myocardial ischemia on the expression of natriuretic peptide receptor in renal cortex of rats

NIU Lijing*，BAI Yun，MIAO Zhihui*，et al．*Institute of Medicine，Hebei Province Center for Disease Prevention and Control，Shijiazhuang 050021，China

【Abstract】Objective To investigate the changes of the expression levels of natriuretic peptide receptor A ( NPR-A) and C ( NPR-C) in renal cortex after myocardial ischemia ( MI) in rats．Methods All the rats were randomly divided into blank control group，sham-operation group and myocardial ischemia group．After MI models were established，the rats were sacrificed，and the expression levels of NPR-A and NPR-C in renal cortex were detected by Western blotting on day 3，7，14，18，28．Results The expression levels of NPR-A in renal cortex were significantly decreased in different time points mentioned above ( P＜0．01)，however，the expression levels of NPR-C were increased from day 3 to day 18，then，which gradually recovered to the levels in blank control group on day 28．Conclusion After myocardial ischemia，the detention of sodium and water in the kidney of rats is closely correlated to the decrease of expression levels of NPR-A and the increase of expression levels of NPR-C．

【Key words】myocardial ischemia; natriuretic peptide receptor; renal cortex; Western blotting; rats

收稿日期:( 2014－08－18)

doi:10．3969/j．issn．1002－7386．2015．04．006

【中图分类号】R 542．2

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386( 2015) 04－0500－04