黄芪多糖对免疫功能影响的体内实验研究

刘印华　赵志强　李树义　张庆波

黄芪多糖对免疫功能影响的体内实验研究

刘印华赵志强李树义张庆波

【摘要】目的探讨黄芪多糖对机体免疫功能的影响，从而为临床应用和相关产品开发提供理论依据。方法每批40只小鼠，随机分为黄芪多糖组1(低剂量)，黄芪多糖组2(中等剂量)和黄芪多糖组3(高剂量)以及正常对照组，每组10只。黄芪多糖组每天灌服0．2 ml浓度为5、10、20 mg/ml的黄芪多糖溶液，正常对照组每天灌服0．2 ml 0．9%氯化钠溶液，10 d后处死，取样测定小鼠各项免疫指标。固有免疫:检测小鼠巨噬细胞吞噬功能;细胞免疫:小鼠后足迟发型超敏反应强度;体液免疫:血凝法测定小鼠血清中溶血素含量;免疫器官:对脾脏和胸腺称重计算脾脏指数和胸腺指数。结果黄芪多糖3组小鼠巨噬细胞吞噬率和吞噬指数明显高于正常对照组( P＜0．01) ;黄芪多糖3组小鼠左右后足重量差与正常对照组小鼠相比，有明显提高( P＜0．01) ;黄芪多糖3组小鼠抗体积数高于正常对照组( P＜0．05) ;黄芪多糖3组小鼠脾脏指数和胸腺指数均较正常对照组小鼠有明显提高( P＜0．01)。结论黄芪多糖可以显著提高机体的固有免疫功能、细胞免疫功能和体液免疫功能。

【关键词】黄芪多糖;固有免疫;细胞免疫;体液免疫;免疫功能

黄芪桂枝五物汤出自《金匾要略·血痹虚劳病脉证治》，原文述“血痹阴阳俱微，寸口关上微，尺中小紧，外证身体不仁，如风痹状，黄芪桂枝五物汤主之。”属于温经散寒剂，具益气温经、和营通脉之功效，方由黄芪、白芍药、桂枝、生姜、大枣五味药组成。《金匮要略方论本义》:“黄芪桂枝五物汤，在风痹可治，在血痹亦可治也。以黄芪为主固表补中，佐以大枣;以桂枝治卫升阳，佐以生姜;以芍药入营理血，共成厥美。”该方用药精当，组方严谨，长期以来备受中医学者青睐，已成为临证常用方剂之一。现代临床应用显示，该方具有较广泛的适应症和较好的临床疗效，已远远超越了原方“血痹”之见症的范畴，尤其是在治疗血液高粘滞综合症、颈椎病、微循环障碍和脑中风后遗症和类风湿性关节炎等方面收到满意的疗效。对复方中各单味药化学成分及药理作用研究，如:黄芪中含有的黄芪多糖、皂苷、黄酮等化合物具有较强的生物活性，黄芪皂苷主要作用于心脑血管，通过扩张血管达到降压目的;黄芪多糖主要作用于多种免疫活性细胞，促进细胞因子的分泌和正常机体的抗体生成。桂枝的有效成分是挥发油，主要为桂皮醛和桂皮酸，可扩张血管，促进发汗、解热、镇痛、镇静、利尿。但对黄芪桂枝五物汤中

的黄芪多糖进行系统的免疫学研究，目前笔者在国内外尚未见文献报道(河北省医学情报研究所，查新编号: 13010520130618)。本项目采用黄芪多糖对小鼠进行体内免疫学实验研究，从而探明黄芪多糖的药物作用机制，为临床应用提供实验基础。

1　材料与方法

1．1材料

1．1．1主要试剂:黄芪多糖由河北联合大学药学院提供。

1．1．2实验动物:昆明小鼠40只: SPF级，雌雄各半，体重( 20±2) g，4～6周龄，购自中国医学科学院实验动物研究所(合格证编号: 0123883)。

1．2方法

1．2．1实验动物分组:将每批次小鼠随机分为4组:黄芪多糖组1(低剂量)、黄芪多糖组2(中等剂量)、黄芪多糖组3(高剂量)、和正常对照组，4组小鼠每组10只，雌雄各半。全部实验小鼠进行适应性喂养10 d后，黄芪多糖组小鼠每天上午灌服0．2 ml浓度为5、10、20 mg/ml的黄芪多糖溶液1次，正常对照组小鼠每天上午灌服0．2 ml 0．9%氯化钠溶液1次，连续10 d，次日处死采集样本。根据实验项目的具体要求进行免疫学检测。

1．2．2巨噬细胞吞噬功能的测定:采用半体内法测定巨噬细胞吞噬功能。每只小鼠腹腔注射4%的淀粉溶液1 ml，24 h后每只小鼠腹腔注射10%鸡红细胞悬液1 ml，30 min后颈椎脱臼处死，固定于操作板上。腹腔注入2 ml 0．9%氯化钠溶液，轻揉腹部1 min。无菌打开小鼠腹腔，吸出1 ml腹腔液，滴于洁净载玻片上，37℃温箱孵育30 min。0．9%氯化钠溶液漂洗，去除未贴片细胞，晾干。甲醇溶液固定，Giemsa-磷酸盐缓冲液染色20 min，蒸馏水漂洗，晾干。在光学显微镜下观察巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬情况，计算吞噬百分率和吞噬指数，计算公式如下:

吞噬百分率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100%

吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数

1．2．3迟发型超敏反应测定:实验小鼠适应性喂养2周后，4组小鼠腹腔内注射10% ( v/v)鸡红细胞( CRBC)悬液。处死前24 h每只小鼠左后足掌注射10% ( v/v) CRBC悬液50 μl，右后足掌注射等量0．9%氯化钠溶液。24 h后处死小鼠，沿相同部位切下小鼠的双后足，在电子天平上精确称重，计算左右后足重量差。

1．2．4血清溶血素含量测定:血凝法检测小鼠血清中溶血素含量。取小鼠血清，用0．9%氯化钠溶液倍比稀释，将不同稀释倍数的血清分别加入微量血凝板内，每孔100 μl。再加入100 μl新鲜制备的0．5% ( v/v)鸡红细胞悬液，充分混匀，置入湿盒内加盖，放置于37℃温箱孵育30 min，观察血凝板中鸡红细胞的凝集程度。血球凝集程度分为5级( 0～Ⅳ)，标准如下: 0 级:红细胞全部下沉，在孔底部集中形成致密圆点状，周围液体清晰。Ⅰ级:红细胞大部分沉集在孔底成圆点状，周围有少量凝集的红细胞。Ⅱ级:凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以有一个明显的疏松的红点。Ⅲ级:凝集的红细胞均匀的铺散在孔底形成一薄层，中心隐约可见一个小红点。Ⅳ级:凝集的红细胞均匀的铺散在孔底形成一薄层，凝块有时可成卷折状。

依据下列公式计算抗体积数:

抗体积数= ( S1 +2S2 +3S3 +．．．．．．nSn)

公式中1、2、3．．．．．．n分别代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示小鼠体内抗体水平越高。

1．2．5小鼠脏器指数测定:将小鼠处死，称其体重，取脾脏和胸腺，电子天平分别称重，计算胸腺指数和脾脏指数。

胸腺指数=胸腺重量( mg) /小鼠体重( g)

脾脏指数=脾脏重量( mg) /小鼠体重( g)

1．3统计学分析应用SPSS 13．0统计软件，计量资料以珋x±s表示，组间比较采用方差分析及q检验，计数资料采用χ2检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2　结果

2．1巨噬细胞吞噬功能比较采用半体内法测定巨噬细胞吞噬功能，能反映机体固有免疫功能状态。结果显示，黄芪多糖组小鼠巨噬细胞吞噬率及吞噬指数均显著高于正常对照组( P＜0．01)。见表1。

表1　4组小鼠巨噬细胞吞噬率及吞噬指数比较

2．2后足迟发型超敏反应强度比较小鼠左右后足重量差越大，表示迟发型超敏反应引起的炎性反应强度越大，小鼠机体内细胞免疫功能越强。结果显示:与正常对照组相比，黄芪多糖组左右后足重量差显著提高( P＜0．01)。见表2。

2．3血清溶血素含量比较血清溶血素含量能反映

机体的体液免疫功能状态，结果显示，黄芪多糖组抗体积数显著高于正常对照组抗体积数，差异有统计学意义( P＜0．05)。见表3。

表2　4组小鼠左右后足重量差比较n =10，g，珋x±s

表3　4组小鼠抗体积数比较　n =10，珋x±s

2．4脏器指数比较机体受抗原刺激后，会发生免疫反应，即淋巴细胞活化增殖，免疫器官的重量增加，免疫功能增强。结果显示，黄芪多糖组与正常对照组相比脾脏指数和胸腺指数均显著增高( P＜0．01)。见表4。

表4　4组小鼠小鼠脾脏指数和胸腺指数的比较

注:与对照组比较，*P＜0．01

3　讨论

黄芪是一种补益类中药，生物活性很强，临床已经大量应用其中药制剂，其中黄酮、皂苷、黄芪多糖等几种化学物质为黄芪的主要有效成份，也是发挥生物活性的成份。黄芪多糖主要作用于多种免疫活性细胞，促进细胞因子的分泌和正常机体的抗体生成。对于黄芪的应用，早有黄芪桂枝五物汤，方剂出自《金匮要略·血痹虚劳病脉证并治》，原文述“血痹阴阳俱微，寸口关上微，尺中小紧，外证身体不仁，如风痹状，黄芪桂枝五物汤主之”。属于温经散寒剂，具益气温经、和营通脉之功效，方由黄芪、白芍、桂枝、生姜、大枣五味药组成。《金匮要略方论本义》记载“黄芪桂枝五物汤，在风痹可治，在血痹亦可治也。该方用药精当，组方严谨，备受中医学者青睐，已成为临证常用方剂之一。

目前，多糖的生物学作用越来越引起人们的重视，孟岩等［1］研究了酵母多糖对肉鸡生长性能和肠黏膜形态的影响，侯建明等［2］报道了银耳多糖对免疫功能影响，杨铁虹等［3］探讨了当归多糖对小鼠免疫功能的调节作用，张建峰等［4］研究了红曲多糖的免疫活性，但黄芪多糖对机体免疫功能影响的系统深入研究目前尚未见文献报道。

机体的免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成，免疫功能是在免疫细胞和免疫分子相互作用下完成的，免疫系统根据对抗原的免疫识别而发挥作用。免疫可分为固有免疫和适应性免疫，固有免疫又称为非特异性免疫或天然免疫;适应性免疫又称为特异性免疫或获得性免疫，由体液免疫( B细胞介导的免疫)和细胞免疫( T细胞介导的免疫)组成。巨噬细胞是机体固有免疫的主要细胞之一，在固有免疫和适应性免疫中均起重要作用，具有吞噬、杀伤、提呈抗原、分泌生物活性物质、调控机体免疫以及抑制肿瘤等多种功能［5－7］。迟发型变态反应的强度，能较好的体现机体的细胞免疫功能状态［8］，迟发型变态反应的增加表明细胞免疫功能的增强。抗体是机体杀灭病原菌和清除外来抗原的重要免疫活性物质，体内抗体的含量是机体体液免疫功能状态的标志，体内抗体含量的增加说明体液免疫功能的增强。脾脏和胸腺为小鼠重要的免疫器官，主要由免疫细胞构成，其重量是免疫功能的物质基础。当免疫器官的重量增加，其相对于体重的比值即增加，用脏器指数表示。脏器指数的变化，能够反映机体免疫功能的状态［9，10］。

本研究结果显示:与正常对照组相比较，黄芪多糖组的小鼠巨噬细胞吞噬功能增强;左右后足重量差增大，即迟发型变态反应引起的炎性反应强度变大;血清中溶血素含量增加;脾脏指数和胸腺指数都有所提高;说明黄芪多糖通过对机体非特异性免疫、特异性免疫及免疫器官等作用，从而增强机体免疫功能。

参考文献

1孟岩，张辉．酵母多糖对肉鸡生长性能和肠黏膜形态的影响．中国饲料，2007，21: 30-32．

2侯建明，王爱东，雷清新，等．银耳多糖对免疫功能影响的实验报告．中国疗养医学，2007，16: 641-643．

3杨铁虹，贾敏，梅其炳．当归多糖对小鼠免疫功能的调节作用．中成药，2007，5: 563-565．

4张建峰，昌友权，陈光，等．红曲多糖的免疫活性研究．食品科学，2009，29: 391-393．

5Dvorak RA．Effects of Bio-Mos，FOS and Carbadox on Del’-formance of pigs Days 0-21 postweaning．J Anim Sci，1998，32: 95-98．

6陈小兵，丁宏标，乔宇．酵母多糖的益生作用、免疫机制与应用技术．中国畜牧兽医，2005，32: 6-8．

7Peter Spring．糖类在微生物中的作用．中国畜牧兽医，2006，33: 1-2．

8田维毅，杨娟，王平．四物汤等复方多糖组分对小鼠腹腔巨噬细胞释放细胞因子的影响．中华中医药杂志，2009，24: 515-517．

9祁林，刘丽芳．黄丹凝胶抗炎及免疫抑制的实验研究．中华中医药学刊，2008，26: 1007-1009．

10高天芸，孙玉芹，周娟，等．黄芩苷对化疗药物所致小鼠免疫低下的调节作用．中国生化药物杂志，2007，28: 327-329．

·论著·

项目来源:唐山市科学技术研究与发展计划(编号: 13130253z)

作者单位: 063305河北省南堡盐场医院(刘印华) ;河北联合大学(赵志强、李树义、张庆波)

Effects of Astragalin polysaccharides on immune function in vivo

LIU Yinhua*，ZHAO Zhiqiang，LI Shuyi，et al．*Nanpu Salt Factory Hospital，Hebei，Tangshan 063305，China

【Abstract】Objective To investigate the effects of Astragalin polysaccharides on immune function of mice in order to provide theoretical basis for clinical application．Methods Forty mice were randomly divided into four groups: low-dose Astragalin polysaccharide group，median-dose Astragalin polysaccharide group，high-dose Astragalin polysaccharide group and normal control ( NC) group，with 10 mice in each group．The mice in Astragalin polysaccharide groups were given Astragalin polysaccharides 0．2ml by gavage ( 5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml，respectively) per day，however，the mice in NC group were given 0．9% sodium chloride solution 0．2ml by gavage per day．After 10 days，the mice were sacrificed without pain and the specimens were collected from them．The immune function parameters of the mice were examined as follows: ( 1) Innate immune: macrophage phagocytosis was detected; ( 2) Cellular immune: delayed hypersensitivity intensity was tested; ( 3) Humoral immune: hemolysin content in serum was examined by hemagglutination test; ( 4) Immune organ: spleen and thymus indexes were calculated by weighting．Results The phagocyte rate and phagocyte indexes in the three Astragalin polysaccharide groups were significantly higher than those in NC group ( P＜0．01)．As compared with that in NC group，the weight difference between left and right postpedes in Astragalin polysaccharide groups was significantly improved ( P＜0．01)．The antibody titre in Astragalin polysaccharide groups was significantly higher than that in NC group ( P＜0．05)．As compared with those in NC group，the spleen and thymus indexes in Astragalin polysaccharide groups were significantly increased ( P＜0．01)．Conclusion Astragalin polysaccharides can obviously enhance immune function of organism including innate immune，humoural immune and cellular immune．

【Key words】Astragalin polysaccharides; innate immune; cellular immune; humoral immune; immune function

收稿日期:( 2014－08－10)

doi:10．3969/j．issn．1002－7386．2015．04．001

【中图分类号】R 343．9

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386( 2015) 04－0485－03