GLT-1激动剂头孢曲松钠对慢性神经病理性痛的影响

卢丽莉　杨倩　仇艳玲　易力

GLT-1激动剂头孢曲松钠对慢性神经病理性痛的影响

卢丽莉杨倩仇艳玲易力

【摘要】目的探讨头孢曲松钠( Ceftriaxone，Cef)对慢性神经病理性痛过敏及GLT-1表达的影响。方法雄性SD大鼠90只，随机分为Sham组、CCI 14 d组、Cef预防组、Cef治疗组，后2组设腹腔注射NS组为对照，在不同时间点测定热缩足反射潜伏期;另设CCI 1 d、4 d、7 d组。应用免疫组化观察不同时间点脊髓后角GLT-1表达的变化。结果

CCI诱导大鼠产生了热痛敏，腹腔注射NS对CCI诱导的热痛敏无影响。Cef预防组大鼠CCI侧后肢热缩足反射潜伏期于CCI后第5天、第7天明显延长( P＜0．05) ; Cef治疗组大鼠CCI侧后肢热缩足反射潜伏期在术后第11天、第14天明显延长( P＜0．05)。免疫组化检测发现，Cef预防组和Cef治疗组分别抑制和逆转了GLT-1在CCI后期表达的降低。结论Cef可通过上调GLT-1的表达对慢性神经病理性痛起到预防和治疗作用。

【关键词】慢性神经病理性疼痛;头孢曲松钠; GLT-1; CCI

谷氨酸是中枢神经系统最主要的兴奋性神经递质，参与脊髓水平伤害性信息的传递及痛觉过敏的形成［1］。由于胞外没有谷氨酸的代谢酶，胞外谷氨酸的清除主要依靠谷氨酸转运体［2］。目前已克隆出五种高亲和力谷氨酸转运体GLAST ( EAAT1)、GLT-1 ( EAAT2)、EAAC1( EAAT3)、EAAT4和EAAT5［3－7］。众多文献表明，GLT-1在病理性痛和痛过敏的发生和维持中发挥重要作用。2005年Rothstein等［8］在《Nature》上报道，β-内酰胺类抗生素(包括青霉素和一些新的衍生物)具有新的功能，其中头孢曲松( Ceftriaxone，Cef)可增加GLT-1的表达和谷氨酸的摄取。但β-

内酰胺类抗生素是否会对慢性神经病性疼痛过程产生影响尚未报道。本研究观察β-内酰胺类抗生素Cef对CCI大鼠慢性神经病理性痛过敏的影响，并观察脊髓GLT-1表达的变化，为阐明GLT-1在病理性痛中的作用提供依据，为临床上病理性痛的防治提供新线索与思路。

1　材料与方法

1．1实验动物分组健康雄性Sprague-Dawley大鼠90只，体重( 280±20) g，将动物随机分组: Sham组( n =10) :仅暴露坐骨神经不进行结扎;于术前1 d，术后第1天、3天、5天、7天、9天、11天、14天测定热缩足反射潜伏期后，取材观察GLT-1表达的变化。CCI 14 d组:行右侧CCI，其他步骤同Sham组。另设CCI 1 d、CCI 4 d和CCI 7 d组观察CCI后GLT-1表达的动态变化( n =10)。Cef预防( CCI + Cef 7)组( n =10) : 于CCI手术后当天开始腹腔注射Cef，1次/d，共注射7次。于CCI术前1 d，术后第1天、3天、5天、7天观察热缩足反射潜伏期变化。完成上述程序后取材观察GLT-1表达的变化。另设10只动物以相同程序腹腔注射NS为对照( CCI + NS 7)组。Cef治疗( CCI + Cef 14)组( n =10) :于CCI手术后第7天开始腹腔注射Cef，1次/d，共注射7次。其他同Sham组。完成上述程序后取材观察GLT-1表达的变化。另设10只动物以相同程序腹腔注射NS为对照( CCI + NS 14)组。

1．2热缩足反射潜伏期的测定参照Bennett等［9］的方法制作CCI模型。应用BME-410A型热痛刺激仪(光源为12 V/35 W卤素灯)进行。测痛实验台高36 cm，顶部为2 mm厚的石英玻璃板，将有机玻璃板制成的动物笼( 220 mm×220 mm×280 mm，无底，用有机玻璃隔板隔成3个23 cm×11 cm×28 cm的独立空间)置于测痛实验台顶部的石英玻璃板上，将待测动物置于笼内，调节光源与石英玻璃板之间的距离，使落在足底的照射光圈直径5 mm，记录从开始照射至出现缩足逃避反射的时间( s)，作为热刺激缩足潜伏期。重复测量5次，同一部位间隔10 min，不同部位间隔5 min，取平均值作为统计数值。如大于30 s无反应则停止照射，以免导致大鼠足底组织过热损伤。

1．3取材、固定及免疫组化在预定时间点，将动物迅速断头，取出腰5( L5)脊髓节段，将所取标本置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h，经脱水、透明、浸蜡、包埋后，连续横截面切片，片厚约5 μm，石蜡切片经二甲苯透明，常规梯度乙醇脱蜡，3%甲醇-过氧化氢，室温下孵育15 min，10%血清工作液封闭抗原，豚鼠抗GLT-1抗体( 1∶1 000)，4℃冰箱过夜，生物素化二抗IgG(羊抗豚鼠1∶2 000)，37℃恒温水浴锅湿盒内孵育60 min，辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃恒温水浴锅湿盒内孵育50 min，DAB显色，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。每例动物随机选取6张切片，于Olympus光学显微镜下进行定性观察。应用形态学图象分析系统软件(江苏捷达，JEDA801D)进行积分光密度( IOD)、平均光密度( AO)的测量。

1．4统计学分析应用SPSS 11．5统计软件，计量资料以珋x±s表示，采用单因素方差分析( One-Way ANOVA)和t检验( paried t-test)，P＜0．05为差异有统计学意义。

2　结果

2．1热缩足反射潜伏期Sham组大鼠手术侧后肢热缩足反射潜伏期在所观测的14 d内均无明显变化。CCI 14 d组大鼠CCI前热缩足反射潜伏期在14 s左右，于CCI后第3天大鼠CCI侧后肢热缩足反射潜伏期开始下降，与Sham组比较明显缩短( P＜0．05)。术后第5～7天下降到基础值的55%左右，达最低值，一直持续到所测试的第14天。CCI + NS7组CCI侧后肢热缩足反射潜伏期与CCI组比较未见明显变化，而Cef预防组大鼠CCI侧后肢热缩足反射潜伏期于CCI后第5天、第7天同NS对照组相比明显延长。Cef治疗组CCI侧后肢热缩足反射潜伏期在术后第11天、第14天与NS对照组比较明显延长。未手术侧后肢热缩足反射潜伏期在所观测的14 d内各时间点无明显变化。见表1。

表1　大鼠热缩足潜伏期n =10，x珋±s

2．2免疫组化脊髓后角GLT-1表达的变化CCI后脊髓后角GLT-1的表达出现先升高后降低的双向性

变化。与Sham组比较，CCI后第1天和第4天脊髓后角浅层GLT-1的表达显著增强，表现为IOD、AO值明显增加( P＜0．05)。CCI后第7天和第14天脊髓后角浅层GLT-1的表达下降，表现为IOD、AO值明显降低( P＜0．05)。Cef预防组GLT-1的表达较CCI + NS 7组显著升高，表现为IOD、AO值增加( P＜0．05)，表明预先给予的Cef抑制了GLT-1在CCI后期表达的降低。Cef治疗组GLT-1的表达较CCI + NS 7组显著升高，表明GLT-1表达下降后再给予Cef逆转了GLT-1表达的降低，表现为IOD、AO值的增加( P＜0．05)，而CCI + NS 7组GLT-1的表达同CCI 14 d组比较无明显变化。见图1。

图1　腹腔注射0．9%氯化钠溶液或头孢曲松钠后腰5脊髓后脚GLT-1表达的变化A: CCI + NS7组，B: CCI + Cef 7组，C: CCI + NS14组，D: CCI + Cef 14组(免疫组化×100)

3　讨论

谷氨酸是中枢神经系统最主要的兴奋性氨基酸，参与脊髓伤害性信息的传递。由于没有谷氨酸代谢酶，所以胞外谷氨酸的摄取主要靠高效的谷氨酸转运体系统来实现［10，11］。许多研究表明调节谷氨酸转运体的表达和摄取对维持体内谷氨酸的稳态起重要的作用。

研究发现，通过连续腹腔注射Cef 7 d后，Cef可通过血脑屏障进入脑和脊髓，可以选择性地诱发编码GLT-1谷氨酸转运体的基因转录，增加GLT-1的脑内表达，并增强其功能活性［8］。在本实验中观察到CCI大鼠脊髓后角GLT-1的表达出现双向性变化，术后第1天和第4天表达明显升高，术后第7天和第14天表达减少。最初GLT-1的上调作为一种保护性的机制，摄取突触间隙的谷氨酸，减少了这种过度激活导致的有害影响。有研究表明，神经损伤后导致谷氨酸的释放，可反馈性的引起GLT-1的上调［12］。随后GLT-1下调。有人推测这种下调可能是由于失去了初级传入引起的［12］，脊髓的退化性变化也对GLT-1的下调起到了一定作用。后期脊髓GLT-1的下调使脊髓谷氨酸在突触间隙过多蓄积，结果导致谷氨酸受体的异常激活，是脊髓敏感化乃至痛觉过敏产生的重要机制［1］。这样脊髓GLT-1的下调在慢性神经病理性疼痛的产生和维持中起到了重要的作用。本实验观察到腹腔连续注射NS对CCI诱导的热痛敏无影响，而预防性和治疗性腹腔注射Cef 7 d后，发现CCI大鼠CCI侧后肢热缩足反射潜伏期同NS对照组比较明显升高。免疫组化检测发现腹腔注射NS后对GLT-1的表达无显著影响，而腹腔注射Cef预防组和治疗组的GLT-1表达与NS对照组比较均明显增加。GLT-1表达的这种变化在其以上结果表明，腹腔注射Cef可以减轻CCI诱导的热痛敏和机械性痛敏，并且使脊髓GLT-1表达增加。在病理性疼痛状态下，阻断脊髓谷氨酸转运体的摄取后，可导致脊髓谷氨酸的过多蓄积，引起谷氨酸受体过度激活，产生自发性痛和痛觉过敏。腹腔注射Cef激动了GLT-1的表达，从而使脊髓细胞间隙内的谷氨酸维持在低水平，减少谷氨酸受体的过度激活，从而抑制了热痛敏和机械性痛敏的产生和发展。

参考文献

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8Rothstein JD，Patel S，Regan MR，et al．β-lactam antibiotics offer neuroprotection by increasing glutamate transporter expression．Nature，2005，433: 73-77．

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12Minami T，Matsumura S，Okuda-Ashitaka E，et al．Charact-erization of the glutamatergic system for induction and maintenance of allodynia．Brain Res，2001，895: 178-185．

·论著·

项目来源:石家庄市科学技术研究与发展指导计划项目(编号: 131461223)

作者单位: 050011河北省石家庄市第三医院病理科(卢丽莉、易力) ;河北省石家庄市第四医院病理科(杨倩) ;河北省优抚医院老年病科(仇艳玲)

Effect of ceftriaxone on chronic neuropathic pain and the expression of GLT-1 in rats

LU Lili*，YANG Qian，QIU Yanling，et al．*Department of Pathology，The Third Hospital of Shijiazhuang City，Shijiazhuang 050011，China

【Abstract】Objective To investigate the effects of( Ceftriaxone，Cef) on chronic neuropathic pain and the expression of GLT-1 in rats．Methods Ninety male Spague-Dawley rats were randomly divided into sham-operation group，CCI 14d group，Cef prevention group，Cef therapy group，at the same time，the two groups with intraperitoneal injection with NS were designed as control groups for the last two groups．The thermal withdrawal latency was measured in different time points，in addition，CCI 1d，CCI 4d and CCI 7d groups were designed to observe dynamic change of GLT-1 expression after CCI．The changes of GLT-1 expression in dorsal horn of spinal cord were detected by immunohistochemistry．Results The thermal hyperalgesia in rats was induced by chronic crushing injury( CCI)，however，intraperitoneal injection with NS had no effect on thermal hyperalgesia induced by CCI．The thermal withdrawal latency was obviously prolonged in Cef prevention group on the 5th day，the 7th day after CCI( P＜0．05)，moreover，which in Cef therapy group was significantly prolonged on the 11th day，14th day after CCI( P＜0．05)．The results by immunohistochemisty showed that Cef prevention group and Cef therapy group inhibited and reversed the down-regulation of GLT-1 expression at CCI later period．Conclusion The Cef can prevent and treat chronic neuropathic pain by up-regulating the expression of GLT-1．

【Key words】chronic neuropathic pain; ceftriaxone sodium; GLT-1; CCI

收稿日期:( 2014－05－10)

doi:10．3969/j．issn．1002－7386．2015．04．004

【中图分类号】R 441．1

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386( 2015) 04－0494－03