4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231诱导分化作用及可能的机制研究

雷　静，陈飞虎，葛金芳，李　悦，高文凡，邓子云(安徽医科大学药学院，安徽合肥　230032)



4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231诱导分化作用及可能的机制研究

雷静，陈飞虎，葛金芳，李悦，高文凡，邓子云
(安徽医科大学药学院，安徽合肥230032)

中国图书分类号: R329.24; R329.11; R737.902.2; R916.4

摘要:目的观察4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(4-anino-2-trifluoromethyl-phenyl retimate，ATPR)对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231抑制增殖诱导分化作用，探讨其可能的作用机制。方法体外培养人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，MTT检测细胞增殖，绘制细胞生长曲线，瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态变化，酶联免疫法检测粘蛋白MUC-1活性，流式细胞术检测细胞周期，实时荧光定量PCR法和Western blot法检测维甲酸受体(retinoic acid receptors，RAR)RARα、RARβ、RARγ和维甲类受体(retinoid X receptors，RXR)RXRα、RXRβ、RXRγ基因和蛋白的表达。结果ATPR能够抑制MDA-MB-231细胞的增殖，具有浓度-时间依赖性，染色后镜下观察MDA-MB-231细胞生长密度降低，形态趋于正常。ELISA结果显示，ATPR作用后明显降低MDA-MB-231细胞培养上清中MUC-1的浓度;流式细胞术结果显示，MDA-MB-231细胞中G0/G1期表达量增加，S期表达量减少，细胞阻滞在G0/G1期比例增加。q-RT-PCR和Western blot结果显示，ATPR作用后，RARγ的mRNA和蛋白表达水平降低，RXRs mRNA和蛋白水平无明显变化。结论ATPR可以抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖并诱导其分化，其机制可能与RARγ的表达有关。

关键词:全反式维甲酸;4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯;诱导分化; MDA-MB-231细胞;维甲酸受体;维甲类受体;雌激素受体;

网络出版时间:2015－6－5 11:22网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.017.html

陈飞虎(1962－)，男，教授，博士生导师，研究方向:分子药理学，通讯作者，Tel: 0551-65161116，E-mail: cfhchina @ sohu.com

维甲酸类化合物在脊椎动物发育、细胞分化和维持机体平衡中发挥着非常广泛的效应，在体内生理活性代谢产物包括全反式维甲酸、13-顺式维甲酸、9-顺式维甲酸，它们可以通过和细胞核内维甲酸受体(RARs)和维甲类受体(RXRs)结合于DNA的应答元件，进而调节靶基因的表达，发挥抑制细胞增殖和诱导分化作用。全反式维甲酸(all trans retinoic acid，ATRA)作为诱导分化剂的代表目前广泛用于急性早幼粒白血病的临床治疗［1］，但同时存在维甲酸综合征耐药性等不足限制其进一步临床使用［2－4］。本实验室以ATRA为先导化合物，通过对其碳链末端极性基团进行结构修饰，合成了一系列新的维甲酸衍生物，经过体外药效学筛选发现4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯具有较强的抗肿瘤增殖和诱导分化活性，有望成为一种新型抗肿瘤药。课题组前期研究发现4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(4-anino-2-trifluoromethyl-phenyl retimate，ATPR)对多种肿瘤细胞具有诱导分化作用［5－8］，本实验观察ATPR对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231是否具有诱导分化作用，并探究ATPR对维甲酸受体RARs及维甲类受体RXRs表达的影响。

1　材料与方法

1.1材料新型维甲酸衍生物由安徽医科大学药学院合成(Fig 1)，纯度为99. 66 %，溶于无水乙醇，配制成1×10－2mol·L－1浓度，－20℃储存备用。高糖DMEM培养液为Hyclone公司产品;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;瑞氏－吉姆萨染料购自南京建成生物工程研究所; MUC-1试剂盒为美国R＆D公司产品;逆转录试剂盒和PCR试剂盒均为Promage公司产品; q-PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;实时荧光定量PCR仪，立陶宛Fermentas公司产品;抗RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγ抗体购自Santa Cruz公司;β-actin抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

Fig 1　Chemical structure of 4-Amino-2-Trifluoromethyl-Phenyl Retinate(ATPR)

1.2细胞培养MDA-MB-231细胞株购自中科院上海细胞所，采用含10 %胎牛血清(FCS)的DMEM培养液，并加入青霉素105IU·L－1和链霉素100 mg ·L－1的培养体系培养。培养环境为37℃，5 % CO2培养箱，每2天换1次液，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 MTT法检测细胞增殖将MDA-MB-231细胞以3×104个/孔的浓度接种于96孔培养板，每孔接种量为100 μL。待细胞贴壁后，分为空白对照组(加入DMEM培养液100 μL)、溶剂对照组(含0. 05 %无水乙醇)、阳性对照组ATRA(10－5mol·L－1)及ATPR(10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9mol·L－1)组，每组设6个复孔，每孔的总体积为200 μL。分别于24、48、72、96 h后更换为无血清培养液，并加入MTT(浓度为5 g·L－1)20 μL，继续培养4 h后，弃上清，每孔加入150 μL的DMSO，震荡摇匀，使甲瓒颗粒充分溶解。于酶联免疫检测仪上，以波长490 nm，试剂对照组调零，测吸光度(A490)值，重复3次，取其平均值，并用SPSS计算IC50值。

1.4细胞生长曲线绘制将MDA-MB-231细胞以1×104个/孔的浓度接种于24孔培养板，每孔接种量为1 mL。待细胞贴壁后，实验分组同“1. 3”，将其置于37℃含5 % CO2培养箱中，培养1～7 d。每天进行细胞计数，每个时间点设3个复孔，取其均值，以培养时间为横轴，细胞计数为纵轴，绘制细胞生长曲线。

1.5细胞形态学观察以1×106个/孔的浓度接种于6孔板，每孔加入盖玻片，将细胞悬液滴于盖玻片上，实验分组同1.3，作用72 h收集盖玻片，用PBS冲洗盖玻片，甲醇固定10 min，自然干燥，在盖玻片上依次滴加瑞氏－吉姆萨染料A液和B液，流水冲洗细胞，干燥后在显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.6分化标志物MUC-1检测取对数生长期细胞，以1×104个/孔的浓度接种于24孔板，待细胞贴壁后，实验分组同1.3，作用72 h后，收集细胞上清，3 000 r·min－1离心10 min后，参照试剂盒方法检测MUC-1。

1.7细胞周期和DNA倍体分析取对数生长期细胞，以1×106个/孔的浓度接种于6孔板，实验分组同1.3，作用72h后，收集细胞，用PBS洗涤2次，70%冷乙醇－20℃冰箱固定过夜。固定后的细胞离心，弃上清，加入碘化丙啶(PI，终浓度为100 mg· L－1)和RNase(终浓度为50 mg·L－1)，4℃避光染色30 min后，在EPICS XL-MCL型流式细胞仪上分析，检测3×104以上细胞，并用ModfitLT软件进行DNA倍体及细胞周期分析。

1.8实时定量荧光逆转录聚合酶链反应(q-RTPCR)检测RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγmRNA的表达

1.8.1 RNA提取和逆转录将1×109·L－1细胞接种于培养瓶，实验分为空白对照组(加入DMEM培养液)、溶剂对照组(含0.05%无水乙醇)、阳性对照组ATRA(10－5mol·L－1)及ATPR(10－5mol ·L－1)组，作用72 h后，按TRIzol一步法提取细胞中总RNA，以紫外分光光度计测RNA含量和纯度(RNA在260和280 nm的光密度比值为1. 8～2. 0)，以1. 5%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性(28S 和18SRNA条带比值I＞2. 0)，用5 μg总RNA为模板，逆转录成cDNA。

Tab 1　Oligonucleotide primer sequences used for q-RT-PCR analysis

1.8.2 q-RT-PCR将cDNA用无酶水稀释10倍，上、下游引物各稀释10倍后，按以下体系将反应物加至q-RT-PCR反应板中，每组至少3个复孔，冰上操作: Syber green I: 5 μL; cDNA: 0. 5 μL; P1: 0. 3 μL; P2:0. 3 μL;无酶水: 3. 9 μL共10 μL体系。反应条件1:预变性95℃，10 min;变性95℃15 s;反应条件2:退火95℃15 s;60℃30 s;延伸72℃30 s，45个循环后，延伸7℃230 s。扩增反应结束后取出96孔反应板，关闭仪器，分析数据，若观察到各基因熔解曲线为锐利的单一峰，说明扩增序列特异性强，定量准确。

1.9 Western blot检测RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγ蛋白的表达将1×109·L－1细胞接种于培养瓶中，实验分组同“1. 8. 1”，作用72 h后，弃培养液，用预冷的PBS洗3遍，每瓶加入400μL RIPA裂解液(含10 % PMSF)裂解30 min，用细胞刮快速将细胞转入1. 5 mL EP管中，离心取上清，用BCA蛋白定量试剂盒进行定量。将上清与上样缓冲液按4∶1进行分装，100℃煮10 min变性，－80℃保存待用。等量的蛋白样品进行SDSPAGE，将电泳分离的蛋白转移到PVDF膜上。TBST洗膜10 min，室温下用含5 %的脱脂奶粉(TBST溶解)封闭3 h，随后加入一抗(1∶300)4℃孵育过夜，TBST洗脱4次，加入相应的二抗孵育1 h，用TBST漂洗4次，将PVDF膜用化学发光剂染色1 min。

2　结果

2.1 ATPR对MDA-MB-231细胞增殖的影响如Tab 2所示，与空白对照组相比，溶剂对照组A490变化不明显，表明无水乙醇(0.05 %)作为溶剂对细胞增殖无影响，因此可排除无水乙醇对本实验的影响。显微镜下观察各组细胞发现，与溶剂对照组比较，ATPR(10－4mol·L－1)体外给药24 h时即对MDA-MB-231细胞的增殖产生明显影响，细胞形态皱缩，细胞凋亡; ATPR(10－5、10－6、10－7、10－8、10－9mol·L－1)体外给药24 h时对MDA-MB-231细胞增殖并无明显影响，但作用48、72和96 h后，ATPR(10－5、10－6、10－7、10－8、10－9mol·L－1)对细胞增殖均具有不同程度的抑制作用。如Fig 2所示，72 h时ATPR对MDA-MB-231细胞抑制作用的IC50值最低。

Tab 2　Effects of ATPR on the proliferation of MDA-MB-231 cells(±s，n =3)

Tab 2　Effects of ATPR on the proliferation of MDA-MB-231 cells(±s，n =3)

**P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs the solvent group.

Concentration/A490 Group－124 h　48 h　72 h　96 h mol·L Control　0.303±0.02 　0.537±0.055 　0.867±0.0690.942±0.043 Solvent　0.329±0.04 　0.535±0.041 　0.972±0.023 　0.951±0.040 ATPR 　10－4　0.081±0.016＊＊0.079±0.018＊＊0.088±0.009＊＊0.070±0.06＊＊10－5　0.325±0.038 　0.477±0.036*0.584±0.068＊＊0.668±0.104*10－6 　0.349±0.050 　0.489±0.055* 　0.606±0.018＊＊0.735±0.074* 10－7 　0.362±0.030 　0.552±0.049 　0.604±0.084* 　0.772±0.112 10－8 　0.359±0.047 　0.563±0.067 　0.764±0.044 　0.851±0.091 10－9　0.363±0.034 　0.597±0.068 　0.789±0.104 　0.914±0.103 ATRA 　10－5　0.331±0.038 　0.463±0.03＊＊　0.578±0.074＊＊0.642±0.073

3.2 MDA-MB-231细胞生长曲线绘制台盼蓝染色后绘制细胞生长曲线，结果如Fig 3所示，与溶剂对照组比较，ATPR浓度越大，细胞生长曲线越低平，其中10－5mol·L－1ATPR对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用最强，用药后24h开始出现抑制作用，并且在72 h抑制作用最明显，说明ATPR对MDAMB-231细胞的抑制作用具有浓度－时间依赖性。

Fig 2　ATPR inhibits the half inhibition concentration(IC50)in MDA-MB-231 cells(±s，n =3)

Fig 3　Growth curves of MDA-MB-231 cells treated with ATPR(±s，n =3)＊＊P＜0. 01 vs the solvent group.

2.3细胞形态学观察不同浓度ATPR作用后，MDA-MB-231细胞形态学变化如Fig 4所示，正常组细胞生长密度大，细胞形态不规则，ATPR用药后细胞生长密度降低，核质比降低，细胞形态规则，细胞形态随药物浓度增加改变越明显。

2.4分化标志物MUC-1的检测ATPR作用后观察MDA-MB-231细胞上清中MUC-1的变化，结果如Tab 3所示，与溶剂对照组相比，MUC-1含量随ATPR浓度的升高而下降，ATPR浓度为10－5mol·L－1时MUC-1含量下降最明显，差异具有统计学意义。

2.5 MDA-MB-231细胞周期变化如Fig 5所示，FCM检测细胞周期显示，与溶剂对照组相比，ATRA(10－5mol·L－1)和ATPR(10－5、10－6mol·L－1)用药后，G0/G1期细胞百分比上升，S期细胞百分比下降，差异有统计学意义(P＜0. 05); G2/M期细胞改变不明显。结果表明ATPR影响MDA-MB-231细胞周期，将细胞阻滞在G0/G1期。

Fig 4　Effect of ATPR on the morphological changes of MDA-MB-231 cells after 72h(400×)1: Control;2: Solvent;3: ATPR(10－5mol·L－1);4: ATPR(10－6mol·L－1); 5: ATPR(10－7mol·L－1); 6: ATPR(10－8mol·L－1); 7: ATPR(10－9mol·L－1);8: ATRA(10－5mol·L－1).

Fig 5　Change of cell cycle distribution of MDA-MB-231 cells treated with ATPR(n =3，±s)1: Control;2: Solvent;3: ATPR(10－5mol·L－1);4: ATPR(10－6mol·L－1);5: ATPR(10－7mol/L);6: ATPR(10－8mol·L－1);7: ATPR(10－9mol·L－1);8: ATRA(10－5mol·L－1)，*P＜0.05，＊＊P＜0. 01 vs the solvent group.

Tab 3　Effect of ATPR on the concentration of mucin 1(MUC-1)(±s，n =3)

Tab 3　Effect of ATPR on the concentration of mucin 1(MUC-1)(±s，n =3)

*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs the solvent group.

Group 　Concentration/mol·L－1　MUC-1/kU·L－1Control　　－　61.49±1.66 Solvent　　－　61.00±1.28 ATPR　10－5　43.87±1.37＊＊10－6　51.31±2.22*10－7　54.08±3.39 10－8　57.55±3.59 10－9　59.47±1.48 ATRA　10－5　44.08±2.25

2.6 RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγ mRNA的表达结果如Fig 6所示，与溶剂对照组相比，ATPR(10－5mol·L－1)作用后，RARα、RARβ mRNA表达无明显变化，RARγ mRNA表达下降，RXRα、RXRβ、RXRγ mRNA表达无明显变化。提示ATPR用药后MDA-MB-231细胞RARγ mRNA表达下降。

2.7 RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγ蛋白的表达结果如Fig 7所示，与溶剂对照组相比，ATPR(10－5mol·L－1)作用后，RARα、RARβ蛋白表达无明显变化，RARγ蛋白表达下降，RXRα、RXRβ、RXRγ蛋白表达无明显变化。提示ATPR用药后MDA-MB-231细胞RARγ蛋白表达下降。

3　讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，目前对乳腺癌的治疗手段包括手术治疗、全身化疗、放射治疗及内分泌治疗等［9］。放化疗通常不具有选择性，既能杀死肿瘤细胞，又杀死了大量的正常细胞。20世纪80年代Sachs［10］发现在一些抑制增殖和诱导分化的物质作用下，小鼠白血病细胞系的异常分化是可逆的，由此提出了诱导分化治疗的概念。诱导分化治疗的基本特点是不直接杀伤肿瘤细胞，而是诱导其分化为正常或接近正常的细胞，减慢肿瘤细胞增殖速度，最终使恶性肿瘤缓解，从而避免常规放、化疗所引起的骨髓抑制、免疫抑制等毒副作用［11］。全反式维甲酸作为经典的诱导分化剂，已广泛应用于急性早幼粒白血病的临床治疗，但ATRA存在一系列的问题，如维甲酸综合征耐药等影响其疗效，本课题组以ATRA为先导化合物，合成的维甲酸衍生物ATPR对多种肿瘤细胞株具有抑制增殖诱导分化作用，前期研究发现，ATPR对雌激素受体阳性人乳腺癌细胞株MCF-7具有诱导分化作用，本实验探讨在雌激素受体阴性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231上，ATPR对其是否具有诱导分化作用?实验结果表明，ATPR抑制MDA-MB-231细胞的增殖存在浓度－时间依赖性行为。

Fig 6　Effect of ATPR on the mRNA expression of retinoic acid receptors(RARs)and Retinoid X acid receptor(RXRs)in MDAMB-231 cells(n =3，±s)1: Control; 2: Solvent; 3: ATRA(10－5mol·L－1); 4: ATPR(10－5mol·L－1).＊＊P＜0. 01 vs the solvent group.

Fig 7　Effect of ATPR on the proteins expression of retinoic acid receptors(RARs)and retinoid X receptors(RXRs)in MDA-MB-231 cells(n =3，±s)1: Control;2: Solvent; 3: ATRA(10－5mol·L－1); 4: ATPR(10－5mol·L－1).＊＊P＜0. 01 vs the solvent group.

细胞分化主要表现在形态和功能两个方面，形态分化是细胞分化的基本特征。瑞氏－吉姆萨染色结果显示，MDA-MB-231细胞经ATPR处理后形态发生改变，细胞生长密度下降，核质比降低。MUC-1是一种在上皮性肿瘤高度或异常表达的膜糖蛋白，常作为乳腺癌细胞分化程度的一个重要指标［12］。研究发现，ATPR作用后，MDA-MB-231细胞分泌MUC-1含量为(43. 87±1. 37)kU·L－1，较溶剂对照组(61. 00±1. 28)kU·L－1差异有显著性。细胞形态学的改变和分化标志物MUC-1含量的变化都说明ATPR对MDA-MB-231细胞具有诱导分化作用。

肿瘤细胞的周期学特点是细胞群体主要分布于DNA合成活跃S期，而分化细胞群体主要分布于DNA合成静止的G1/G0期。因此细胞周期不可逆的阻滞于G0/G1期是细胞分化的重要特征。本研究结果显示，MDA-MB-231细胞周期发生明显改变，G0/G1期的细胞比例增多，S期细胞比例下降，呈明显的G0/G1期阻滞。说明ATPR可以调控MDAMB-231细胞周期，将其阻滞在G0/G1期比例升高，具有诱导分化效果。

维甲酸受体属于核受体超家族中的一个子家族，在这个超家族中还包括甾体类、维生素D和甲状腺激素受体及过氧化物酶体增殖物激活受体、昆虫脱皮类固醇受体和许多尚未知其配体的孤儿受体。Ayaori等［13］研究表明，维甲酸类化合物如ATRA、9cis RA首先通过与细胞质的维甲酸结合蛋白Ⅰ、Ⅱ(CRABPⅠ、CRABPⅡ)结合，转运至细胞核，与核受体RARs和RXRs形成的同/异二聚体结合，从而发挥抑制细胞生长、分化以及凋亡等调节作用。维甲酸受体子家族包括: RARs和RXRs，分别有α、β、γ 3种亚型。有文献指出在激素依赖性和非激素依赖性乳腺癌中，维甲酸作用后，维甲酸受体表达各不相同，在MDA-MB-231细胞中RARα、RXRα的表达非常低［14］。本课题组前期研究发现ATPR抑制MCF-7细胞增殖过程中，维甲酸受体RARs、雌激素受体ERs的表达发生变化。根据这一现象我们探讨维甲酸受体在ATPR对MDA-MB-231细胞诱导分化过程发挥怎样的变化? q-PCR和Western blot结果表明与溶剂对照组相比，ATPR用药后，RARγ的表达降低，RARα、RARβ、RXRα、RXRβ和RXRγ表达无明显变化。上述结果提示，ATPR对MDA-MB-231细胞中不同的维甲酸受体表达的影响是不同的，与文献的研究结果一致［14］。

(本实验在安徽省天然药物活性研究重点实验室完成，衷心感谢导师陈飞虎教授对我的课题悉心指导，感谢葛金芳老师在我实验遇到困难时耐心解答，感谢实验室的同学们在实验期间对我实验技术的帮助，最后感谢母校安徽医科大学给我提供良好的学习环境。)

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Inducing effect of 4-Amino-2-Trifluoromethyl-Phenyl Retinate on differentiation of human breast cancer MDA-MB-231 cell and its possible mechanisms

LEI Jing，CHEN Fei-hu，GE Jin-fang，LI Yue，GAO Wen-fan，DENG Zi-yun
(School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032，China)

Abstract:Aim To investigate the effect of 4-Amino- 2-Trifluoromethyl-Phenyl Retinate on human breastcancer cells MDA-MB-231 and the possible mechanisms.Method Human breast cancer MDA-MB-231cells were incubated with different concentrations of ATPR in vitro.MTT assay was performed to measure the proliferation of MDA-MB-231.Cell growth curves were made by counting cells and morphologic changes were observed by Wright-Giemsa staining.The differentiation marker mucin-1(MUC-1)was measured by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Cell cycle was examined by Flow cytometry(FCM).The expression of retinoic acid receptors(RARs)and retinoid X receptors(RXRs)were detected by Western blot and Quantitative real-time PCR(q-RT-PCR)，respectively.Results Compared with solvent group，ATPR could inhibit the proliferation of MDA-MB-231 cells in a time-and dose dependent manner and induce the maturing and normality of morphology.The express of MUC-1 was significantly decreased，and the progres of cell cycle was blocked in the G0/G1-phase.The expression of RARγ was decreased.Conclusions ATPR could inhibit proliferation and induce differention of MDA-MB-231cells，it's associated with RARγ.

Key words:ATRA; ATPR; differentiation; MDA-MB-231cells; RARs; RXRs; ERs

作者简介:雷静(1988－)，女，硕士生，研究方向:中药药理学，E-mail: leijing99@126.com;

基金项目:国家科技部“重大新药创制”科技重大专项(No 2011ZX09401)

收稿日期:2015－03－14，修回日期:2015－04－07

文献标志码:A

文章编号:1001－1978(2015)07－0973－07

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.017