乙醇激活ALDH2对2型糖尿病大鼠睾丸损伤的影响

李徽徽，于　影，贺文欣，周艳梅，柴继侠(蚌埠医学院.组织学与胚胎学教研室，.生理学教研室，安徽蚌埠　33030)



乙醇激活ALDH2对2型糖尿病大鼠睾丸损伤的影响

李徽徽1，于影2，贺文欣1，周艳梅1，柴继侠1
(蚌埠医学院1.组织学与胚胎学教研室，2.生理学教研室，安徽蚌埠233030)

中国图书分类号: R-332; R322.64; R587.1; R587.2; R977. 3

摘要:目的观察乙醇激活乙醛脱氢酶2(ALDH2)对2型糖尿病大鼠睾丸损伤的影响。方法健康♂SD大鼠高糖高脂饮食联合低剂量链脲佐菌素(STZ)(35 mg·kg－1)制备2型糖尿病大鼠模型。成模后，将大鼠随机分为正常对照组、2型糖尿病组、乙醇+ 2型糖尿病组(n =6)。乙醇+ 2型糖尿病组大鼠先给予体积分数0. 025乙醇喂养1周后，改用体积分数0. 05乙醇继续喂养7周;正常对照组和2型糖尿病组大鼠常规喂养8周。8周后，测定血糖、糖化血红蛋白、血清睾酮、睾丸质量系数等指标，观察睾丸组织结构改变，检测睾丸组织ALDH2 mRNA、转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA水平和TGF-β1阳性率的变化。结果与正常对照组比较，2型糖尿病组大鼠血糖、糖化血红蛋白和睾丸质量系数均明显升高，血清睾酮水平明显降低，睾丸组织中部分生精小管萎缩，各级生精细胞减少，排列疏松，睾丸间质细胞减少，睾丸组织ALDH2 mRNA水平明显减少，TGF-β1 mRNA水平和TGF-β1阳性率明显升高。给予乙醇干预后，与2型糖尿病组比较，乙醇+ 2型糖尿病组大鼠血糖、糖化血红蛋白和睾丸质量系数降低，血清睾酮水平升高，病理改变减轻，睾丸组织ALDH2 mRNA水平明显升高、TGF-β1 mRNA水平和TGF-β1阳性率明显降低。结论激活ALDH2可能通过下调TGF-β1的表达，减轻2型糖尿病对睾丸的损伤。

关键词:2型糖尿病;乙醛脱氢酶2;睾丸;转化生长因子β1;乙醇;链脲佐菌素;大鼠

网络出版时间:2015－6－5 11:22网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.015.html

柴继侠(1976－)女，硕士，副教授，硕士生导师，研究方向:神经疾病和糖尿病的机制研究，Tel: 0552-3175282，E-mail: chaichai123456@163.com

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一组以慢性血糖水平增高为特征的代谢疾病群，其中90%以上为2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)［1］。糖尿病并发症可涉及多种器官，随着糖尿病发病率的升高及发病年龄的降低，糖尿病并发男性生殖功能障碍作为典型的并发症之一倍受关注。

乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)是线粒体内一种重要的醛类氧化酶，是体内重要的抗氧化应激的保护因子之一，与生物氧化关系密切，广泛分布于心脏、肝脏、肾脏和睾丸等组织中［2］。Murata等［3］观察到少量或适量的外源性乙醇可以激活ALDH2的表达。已有实验观察到激活ALDH2可以减轻糖尿病大鼠心肌损伤［4］，肾脏损伤［5］和肝脏损伤［6］。大量研究显示，线粒体ALDH2具有抗氧化应激损伤的作用，但激活ALDH2是否对糖尿病大鼠的睾丸损伤有保护作用至今尚无报道。本研究通过低剂量乙醇激活ALDH2，观察是否能在T2DM大鼠睾丸组织中发挥保护作用，为其临床新用途提供实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物和材料4～5周龄清洁级♂SD大鼠18只，体质量(100±10)g，蚌埠医学院实验动物中心提供，动物合格证号: 0005237，许可证号: SCXK2009(苏)－0001。

链脲佐菌素(streptozocin，STZ)购自美国Sigma公司;免疫组化SP试剂盒，小鼠抗大鼠TGF-β1多克隆抗体，DAB显色剂均购自武汉博士德生物科技有限公司。大鼠血清睾酮定量ELISA试剂盒购自美国R＆D公司; TRIzol试剂购自Invitrogen公司;逆转录试剂盒和PCR试剂盒购自MBI Fermentas公司; ALDH2、TGF-β1、β-actin引物均由上海生物工程公司合成。引物序列见Tab 1。

Tab 1　The primer squences for each gene

1.2方法

1.2.1 T2DM模型制备及分组大鼠适应性饲养1周，随机分为T2DM模型组和正常对照组(NC组)。T2DM模型组大鼠每日给予高脂高糖乳剂灌胃，NC组大鼠每日给予生理盐水灌胃。6周后，禁食12 h，T2DM模型组大鼠一次性腹腔注射新配制的STZ 35 mg·kg－1，分别于给药72 h后和7 d后尾静脉采血测血糖，以两次随机血糖≥16. 7 mmol·L－1确定为T2DM模型建立成功［7］; NC组大鼠给予等量枸橼酸－枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。将T2DM模型组中造模成功的大鼠随机分为2型糖尿病组(T2DM组)和乙醇+ 2型糖尿病组(EtOH + T2DM组)。EtOH + T2DM组大鼠先给予体积分数为0. 025乙醇适应性喂养1周后，改用体积分数0. 05乙醇继续喂养7周［5］; NC组和T2DM大鼠常规喂养8周。

3组大鼠干预8周后，清晨空腹称体重，采集大鼠血液及睾丸组织标本，提前死亡的大鼠排除在外。

1.2.2空腹血糖及糖化血红蛋白测定尾静脉取血测定空腹血糖(FBG)水平，水合氯醛麻醉后从右侧颈总动脉采血1. 5 mL，置于肝素抗凝管中，台式离心机4℃，4 000 r·min－1离心5 min，分离红细胞，测定糖化血红蛋白(HbA1c)水平。

1.2.3血清睾酮测定右侧颈总动脉取血2 mL，台式离心机4℃，3 000 r·min－1离心15 min后，收集血清，－80℃冰箱保存。ELISA检测大鼠血清睾酮水平。

1.2.4睾丸组织病理学检查大鼠处死后，速取睾丸并称重，计算睾丸质量系数(睾丸重量/体重)。左侧睾丸－80℃冰箱保存，后期做RT-PCR。右侧睾丸置于4%多聚甲醛固定液中固定，石蜡包埋，切成5 μm薄片，苏木精伊红染色。

1.2.5 RT-PCR检测大鼠睾丸组织中ALDH2 mRNA和TGF-β1 mRNA水平采用TRIzol一步提取左侧睾丸组织总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增条件: 95℃预变性3 min后，以①95℃50 s变性，②β-actin退火温度59. 4℃50 s; ALDH2退火温度59. 8℃50 s; TGF-β1退火温度58. 5℃50 s，③72℃60 s，反应30个循环，最后一轮延伸10 min。将PCR扩增产物与溴酚兰混匀，于15 g·L－1的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭显色。在GIS凝胶处理系统对凝胶图像拍摄记录，并使用图像分析软件扫描凝胶中每一扩增条带吸光度做半定量分析，以目的基因与内参对照的吸光度比值(ALDH2/β-actin，TGF-β1/β-actin)表示mRNA相对表达量。

1.2.6免疫组化测定睾丸组织中TGF-β1的表达

睾丸组织切片脱蜡、水化，枸橼酸盐高温修复抗原，过氧化氢封闭。加一抗，4℃过夜，二抗37℃孵育，DAB显色，苏木精复染细胞核，盐酸乙醇分化，氨水返蓝、脱水、透明、封片。高倍显微镜下随机观察10个视野，生精小管的细胞中出现TGF-β1棕色颗粒的细胞数占细胞总数的百分比为TGF-β1阳性率。

2　结果

除NC组外，T2DM组和EtOH + T2DM组大鼠均出现多食、多饮、多尿、消瘦等症状。

2.1各组大鼠空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)水平的变化与NC组相比，T2DM组和EtOH + T2DM组大鼠FBG和HbA1c明显升高(P ＜0. 01)，与T2DM组相比，EtOH + T2DM组大鼠FBG和HbA1c水平降低(P＜0. 05，Tab 2)。

Tab 2　Levels of fasting blood glucose(FBG)and glycosylated hemoglobin(HbA1c)in different groups(±s，n =6)

2.2各组大鼠睾丸质量系数(TW/BW)、血清睾酮的变化与NC组相比，T2DM组和EtOH + T2DM组大鼠睾丸质量系数升高，血清睾酮明显降低(P＜0. 05～P＜0. 01)，与T2DM组相比，EtOH + T2DM组大鼠睾丸质量系数降低，血清睾酮升高(P＜0. 05，Tab 3)。

Tab 3　Ratio of testis weight to body weight(TW/BW)and level of testosterone in different groups(±s，n =6)

2.3各组大鼠睾丸组织病理学改变NC组大鼠睾丸组织中生精小管内各级生精细胞丰富，排列有序，多为6～7层，管腔中有大量的精子。T2DM组大鼠睾丸组织中生精小管萎缩，生精细胞数量少，排列紊乱，多为2～3层。EtOH + T2DM组大鼠睾丸组织中生精小管内各级生精细胞较T2DM组明显增多，细胞排列较为有序，管腔中有少量精子(Fig 1)。

Fig 1　Seminiferous tubules of different groups(HE×400)A: Seminiferous tubules of rats in NC; B: Seminiferous tubules of rats in T2DM; C: Seminiferous tubules of rats in EtOH + T2DM

2.4各组大鼠睾丸组织中ALDH2 mRNA和TGF-β1 mRNA水平的变化与NC组相比，T2DM组和EtOH + T2DM组大鼠睾丸组织中ALDH2 mRNA水平明显降低，TGF-β1 mRNA水平明显升高(P ＜0. 01)，与T2DM组相比，EtOH + T2DM组大鼠睾丸组织中ALDH2 mRNA水平明显升高，TGF-β1 mRNA水平明显降低(P＜0. 01，Fig 2、3)。

Fig 2　Expression of ALDH2 mRNAin testis tissue of different groups＊＊P＜0. 01 vs NC;##P＜0. 01 vs T2DM

Fig 3　Expression of TGF-β1 mRNAin testis tissue of different groups＊＊P＜0.01 vs NC;##P＜0.01 vs T2DM

2.5各组大鼠睾丸组织中TGF-β1表达的变化与NC组相比，T2DM组和EtOH + T2DM组大鼠睾丸组织中TGF-β1阳性率明显升高(P＜0. 01)，与T2DM组相比，EtOH + T2DM组大鼠睾丸组织中TGF-β1阳性率明显降低(P＜0. 01，Fig 4)。

Fig 4　Expression of TGF-β1(A)and positive rate of TGF-β1(B)in testis tissue of different groups＊＊P＜0.01 vs NC;##P＜0. 01 vs T2DM

3　讨论

糖尿病作为一种慢性进行性内分泌病及代谢性病，主要表现为其复杂的并发症对身体健康造成严重的危害，生殖系统损伤是其慢性并发症之一。目前，人和动物实验都证明，2型糖尿病对雄性生殖系统的影响以睾丸的组织形态、生精功能和性激素水平的变化为主要表现。本研究通过高糖高脂饮食联合低剂量STZ制备2型糖尿病大鼠模型，通过长期大量高糖、高脂饮食造成大鼠胰岛素抵抗，联合STZ，高度选择性破坏动物的胰岛β细胞，导致2型糖尿病形成［8］。造模后，大鼠出现多饮、多食、多尿的症状，大鼠FBG、HbA1c和睾丸质量系数均明显升高，大鼠睾丸体积缩小，血清睾酮水平明显降低，睾丸组织中部分生精小管萎缩，各级生精细胞减少，排列疏松，并有晚期长形精子细胞滞留现象，睾丸间质中的睾丸间质细胞相对较少，与2型糖尿病患者的症状较一致，说明造模成功。

目前认为，糖尿病的高血糖导致的氧化应激反应是糖尿病并发症发生发展的主要机制。有研究表明，糖尿病并发生殖系统损伤，导致生精细胞凋亡，生精能力减弱、睾丸间质细胞产生睾酮能力下降等均与氧化应激有关。ALDH2作为体内重要的抗氧化应激的保护因子之一，与生物氧化关系密切。Ohta等［9］研究发现，ALDH2活性缺失型PC12细胞更容易受到脂质过氧化的损伤，且细胞存活率低。Weng等［10］发现ALDH2基因敲除的小鼠更容易受乙基叔丁基醚影响，造成生殖系统损伤。本研究观察到2型糖尿病大鼠睾丸组织中ALDH2 mRNA水平明显降低，并与睾丸组织结构的损伤、血清睾酮的减少相关并呈依赖性。提示糖尿病引起的生殖系统损伤可能与睾丸组织中ALDH2降低有关。对2型糖尿病大鼠给予ALDH2激活剂低剂量乙醇干预8周后，观察到大鼠睾丸组织中ALDH2 mRNA水平明显升高，FBG、HbA1c和睾丸质量系数降低，血清睾酮水平升高，睾丸组织中生精小管内各级生精细胞较T2DM组明显增多，提示激活ALDH2可改善糖尿病大鼠生殖系统的损伤。

转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是一种细胞分泌的具有免疫抑制作用的负调控因子［11］，在睾丸内多数细胞(包括睾丸支持细胞、睾丸间质细胞、肌样细胞及生精细胞)均有表达。睾丸中TGF-β1主要由支持细胞和间质细胞分泌，通过自分泌和旁分泌作用，调节睾丸间质细胞的类固醇合成和增殖［12－14］，以及诱导生精细胞的凋亡［15］。多项研究证明，哺乳动物的TGF-β1对精子的产生和发育起调控作用［16］。糖尿病病程中，高血糖可刺激TGF-β1的大量表达［17］。TGF-β1过表达可以抑制睾丸的生精作用，促进生精细胞凋亡。本研究发现，T2DM组大鼠睾丸组织中TGF-β1 mRNA水平和TGF-β1表达较NC组明显增高，并与睾丸组织结构的损伤、血清睾酮的减少相关，并呈依赖性。因此，下调睾丸TGF-β1表达将有助于减轻2型糖尿病并发生殖系统损伤。对2型糖尿病大鼠给予ALDH2激活剂低剂量乙醇干预8周后，大鼠睾丸组织中ALDH2 mRNA水平明显升高，TGF-β1 mRNA水平和TGF-β1表达较T2DM组明显降低，睾丸组织结构和血清睾酮明显改善，提示激活ALDH2可能通过对抗睾丸组织氧化应激损伤，下调睾丸组织中TGF-β1的表达，发挥睾丸保护作用。

因此我们得出结论，糖尿病大鼠睾丸组织中TGF-β1表达升高，而低剂量乙醇激活ALDH2可以下调TGF-β1的表达，从而减轻睾丸的损伤。ALDH2是如何调控TGF-β1的表达，还有待进一步研究。随着研究的逐步深入，利用低剂量乙醇干预或其他干预激活ALDH2，有望为临床上预防、治疗糖尿病生殖系统损伤提供新的思路。

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Effects of activation of ALDH2 by ethanol in testis injury of type 2 diabetic rats

LI Hui-hui1，YU Ying2，HE Wen-xin1，ZHOU Yan-mei1，CHAI Ji-xia1
(1.Dept of Histology and Embryology; 2.Dept of Physiology，Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233030，China)

Abstract:Aim To observe the effects of activation of aldehyde dehydrogenase 2(ALDH2)by ethanol on testis injury of type 2 diabetic rats.Methods Type 2 diabetic rats model were established by high-fat diet combined with low-dose streptozotocin(STZ)injections.After the success of modeling，the rats were randomly divided into 3 groups(n = 6): normal control group(NC)，type 2 diabetes group(T2DM)and ethanol + type 2 diabetes group(EtOH + T2DM).Rats of EtOH + T2DM were treated with low-dose ethanol，then rats of NC and T2DM were given normal diet for 8 weeks.After 8 weeks，the levels of the fasting blood glucose(FBG)，glycosylated hemoglobin(HbA1c)and testosterone were tested，and the ratio of testis weight to body weight(TW/BW)was calculated.Morphological changes of testis tissue were observed by optical microscope.The levels of ALDH2 mRNA and transforming growth factor β1(TGF-β1)mRNA in testis tissue were measured.The expression of TGF-β1 in testis tissue was observed by immunohistochemical staining，then the positive rate of TGF-β1 was calculated.

Results Compared with NC，the levels of FBG， HbA1c and TW/BW increased significantly and the level of testosterone decreased significantly in T2DM.The morphological observation showed that some seminiferous tubules atrophied，spermatogenic cells decreased and arrangemented loosely，Leydig cells decreased in testicular interstitial.The level of ALDH2 mRNA in testis tissue decreased significantly，and the level of TGF-β1 mRNA and the positive rate of TGF-β1 in testis tissue increased significantly.However，compared with T2DM，the levels of FBG，HbA1c and TW/BW decreased，and the level of testosterone increased and the damage of testis tissue was attenuated in EtOH + T2DM.The level of ALDH2 mRNA in testis tissue increased significantly，and the level TGF-β1 mRNA and the positive rate of TGF-β1 in testis tissue decreased significantly.Conclusion Activating ALDH2 can protect testis in type 2 diabetic rats，which may be related to the downregulation of TGF-β1 expression.

Key words:type 2 diabetes mellitus; aldehyde dehydrogenase 2; testis; transforming growth factor β1; ethanol; streptozotocin; rats

作者简介:李徽徽(1981－)，女，硕士，讲师，研究方向:干细胞与组织工程，Tel:0552-3175282，E-mail: dearlxh@163.com;

基金项目:高校省级自然科学研究重点项目(No KJ2014A166);安徽省高等学校自然科学研究项目(No KJ2015B013by);蚌埠医学院自然科学研究资助重点项目(No BYKL1402ZD);蚌埠医学院自然科学研究项目(No Byky1213)

收稿日期:2015－03－07，修回日期:2015－04－10

文献标志码:A

文章编号:1001－1978(2015)07－0962－05

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.015