Gab2通过PI3K/Akt/ARK5/MMP途径影响乳腺癌的侵袭和转移

田红艳，陈萍萍，李　笑，李洪利，任甜甜，张宝刚，尹崇高，刘雨清(潍坊医学院.病理学教研室、.生物科学与技术学院、.医学研究实验中心、.护理学院，山东潍坊　605)



Gab2通过PI3K/Akt/ARK5/MMP途径影响乳腺癌的侵袭和转移

田红艳1，陈萍萍1，李笑2，李洪利3，任甜甜1，张宝刚1，尹崇高4，刘雨清1
(潍坊医学院1.病理学教研室、2.生物科学与技术学院、3.医学研究实验中心、4.护理学院，山东潍坊261053)

中国图书分类号: R329.25; R341; R73-37; R737. 9

摘要:目的探讨Gab2在乳腺浸润性导管癌侵袭和转移中的分子机制，为临床预防乳腺癌的侵袭和转移提供理论依据。方法采用免疫组织化学SP法检测80例乳腺浸润性导管癌组织及癌旁相对正常组织(＞5 cm)中Gab2蛋白表达情况，并分析其表达与乳腺浸润性导管癌临床病理参数的相关性，分析浸润性导管癌中Gab2、MMP-2及MMP-9蛋白表达的相关性。采用Western blot检测乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231中Gab2蛋白的表达情况。采用RNAi技术将小RNA干扰质粒瞬时转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231，应用Western blot检测转染成功后各组细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达情况，应用Transwell 体外侵袭实验检测各组细胞的侵袭性，用EGF刺激细胞后Western blot检测Akt及ARK5的磷酸化情况。结果浸润性导管癌组织中Gab2蛋白的阳性表达率明显高于癌旁正常组织(P＜0. 01)，浸润性导管癌中Gab2蛋白的表达与ER、组织学分期及淋巴结转移密切相关(P＜0. 05)，且其表达与MMP-2及MMP-9蛋白的表达呈正相关; MDA-MB-231细胞系中Gab2蛋白表达量高于MCF-7细胞系中表达量;转染干扰质粒24 h后，与转染空载细胞组相比，SiGab2/MDA-MB-231细胞组中Gab2蛋白的表达量明显降低，结果显示转染成功。同时，SiGab2/MDA-MB-231细胞组穿过Transwell小室人工基膜数量明显减少(P＜0. 05)，并伴有MMP-2、MMP-9蛋白表达降低(P＜0. 05)。用EGF刺激各组细胞，结果显示:在SiGab2/MDAMB-231细胞组Akt及ARK5的磷酸化明显受到抑制。结论

Gab2通过PI3K/Akt/ARK5信号通路影响MMP-2、MMP-9的表达从而促进乳腺癌的侵袭与转移。

关键词:乳腺癌; Gab2; Akt; ARK5; MMP;侵袭;转移

网络出版时间:2015－6－5 11:22网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.025.html

刘雨清(1962－)，女，硕士，教授，研究方向:肿瘤病理学，通讯作者，E-mail: yuqingliu89@ hotmail.com;

尹崇高(1979－)，男，硕士，副教授，研究方向:肿瘤病理学，通讯作者，E-mail: lihongli1213@ sina.com

肿瘤细胞从原发病灶脱落，浸润周围组织及发生远处转移是恶性肿瘤难以治愈的关键。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)能够降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，从而促进肿瘤的侵袭和转移。尤其是MMP-2、MMP-9已成为乳腺癌分期、预后的一个重要分子标志［1－3］。

Gab2支架蛋白是Gabs家族的成员之一，由Gab2(11q14.1)基因编码，研究发现，有10%～15%乳腺癌患者该段染色体存在扩增现象［4－5］。Gab2蛋白被认为是肿瘤相关蛋白，在胶质瘤［6］、卵巢癌［7］、白血病［8］中过表达。本课题组已发现Gab2-Akt-ARK5信号通路参与胶质瘤细胞的侵袭转移［9］。而目前对于Gab2在乳腺癌侵袭和转移中分子机制的研究尚未见报道。因此，本实验通过分析浸润性导管癌组织中Gab2蛋白与MMP-2、MMP-9蛋白的相关性，沉默Gab2基因后检测细胞的侵袭性及用EGF刺激后检测Akt及ARK5的磷酸化情况，从而探讨Gab2在乳腺癌的侵袭转移中的作用及可能的分子机制。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病例资料收集潍坊医学院附属医院2012 年10月～2013年11月80例病理确诊为乳腺浸润性导管癌组织标本及癌旁相对正常乳腺组织(距离肿瘤边缘＞5 cm)作为研究对象，患者均为女性，手术前均未行放疗和化疗。年龄30～74岁(平均50 岁)，临床资料完整。

1.1.2主要试剂兔抗Gab2单抗购自美国Santa Cruz公司;鼠抗MMP-2单抗、兔抗MMP-9单抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司; RPMI 1640培养液和胎牛血清购自美国Hyclone公司; Lipofecter脂质体转染试剂购自碧云天生物技术研究所; Transwell小室购自Corning公司; Matrigel购自BD公司。MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞系由潍坊医学院医学研究实验中心提供。

1.2方法

1.2.1免疫组化SP法每例组织切片4张，1张用PBS代替一抗作阴性对照，其余3张滴加Gab2、MMP-2、MMP-9工作液，其余按试剂盒说明书进行。结果判定［10］:根据阳性细胞占5个以上高倍镜视野(400倍)同类细胞的百分比即阳性细胞率和染色强度来判定，阳性细胞率计分:阳性细胞数＜5%为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，＞75%为4分。细胞染色强度计分:细胞无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两项得分结果相加: 0～1分为阴性，2～7分为阳性。

1.2.2细胞培养MCF-7及MDA-MB-231细胞常规培养。分组:①SiGab2/MDA-231组:插入Gab2目的片段5'-GTGAGAACGATGAGAAATA-3'的小RNA干扰质粒的MDA-MB-231细胞;②Scr/MDA-231组:插入对照小RNA干扰质粒的MDA-MB-231细胞。

1.2.3 Western blot细胞转染后培养24 h，裂解提取细胞总蛋白，制备12% SDS-PAGE凝胶，各组加入等量蛋白后电泳，转膜、封闭，滴加一抗Gab2、MMP-2、MMP-9孵育过夜，二抗孵育后化学发光剂显影，曝光。

1.2.4 Transwell侵袭实验按文献［11］操作后将小室置高倍镜(400×)下观察，随机计数5个高倍镜视野下穿过人工基膜的细胞数，每个实验重复3次，取平均数作为实验结果。

1.3统计学分析实验数据均采用SPSS 17.0进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验，计量资料比较采用独立样本t检验。

2　结果

2.1 Gab2蛋白在乳腺浸润性导管癌和癌旁正常乳腺组织中的表达Gab2蛋白在肿瘤细胞的细胞质中呈棕黄色阳性反应，在乳腺浸润性导管癌组织中阳性表达率为56. 25%(45/80)，在癌旁正常组织中阳性表达率为32. 50%(26/80)(Fig 1A、D)，差异具有统计学意义(P =0. 002)。并且Gab2的表达与ER、淋巴结转移及组织学分期有关(P＜0. 05，Tab 1)。

2.2浸润性导管癌中Gab2与MMP-2、MMP-9蛋白表达的相关性MMP-2、MMP-9阳性染色部位在细胞质，细胞膜中，呈棕黄色，在浸润性导管癌中Gab2蛋白表达增多的组织中MMP-2、MMP-9蛋白表达也增多，在Gab2蛋白表达减少的组织中，MMP-2、MMP-9蛋白表达也减少，两者的表达呈正相关(Fig 1B、C、E、F)(Tab 2)。

Tab 1　Relationship between Gab2 expression and clinical parameters of breast cancer patients

Fig 1　Expression of Gab2，MMP-2 and MMP-9 in breast tissue by immunohistochemical staining(×400)

A: Negative expression of Gab2 in normal breast tissue; B: Positive expression of MMP-2 in normal breast tissue; C: Positive expression of MMP-9 in normal breast tissue; D: Positive expression of Gab2 in invasive ductal carcinoma tissue; E: Positive expression of MMP-2 in invasive ductal carcinoma tissue; F: Positive expression of MMP-9 in invasive ductal carcinoma tissue

Tab 2　Correlativity of Gab2 with MMP-2 and MMP-9 in invasive ductal carcinoma tissue

2.3乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231中Gab2蛋白的表达Gab2蛋白在侵袭性强的MDAMB-231细胞中表达量高于侵袭性弱的MCF-7细胞中的表达量(Fig 2)。

Fig 2　Expression of Gab2 in MDA-MB-231 cells and MCF-7 cells(Values represent gray value)

2.4转染后各组细胞中Gab2、MMP-2及MMP-9蛋白的表达Gab2在SiGab2/MDA-MB-231细胞组中表达明显低Scr/MDA-MB-231细胞组中表达，表明转染成功;同时在SiGab2/MDA-MB-231细胞组中MMP-2、MMP-9蛋白表达下降;差异有显著性(Fig 3)。

Fig 3　Expression of Gab2，MMP-2 and MMP-9 in transfected cells by Western blot(Values represent gray value)

2.5 Gab2对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭性的影响转染干扰质粒后应用Transwell检测结果显示: SiGab2/MDA-MB-231组穿过人工基膜的细胞数比Scr/MDA-MB-231组明显减少(Fig 4)，差异有显著性(P＜0. 05)。

Fig 4　Invasion ability of each group transfected MDA-MB-231 cells(Giemsa×200)A: Scr/MDA-MB-231 cells; B: SiGab2/MDA-MB-231 cells; C: The number of invasive cells in SiGab2/MDA-MB-231 decreased compared with Scr/MDA-MB-231.*P＜0. 05 vs Scr/MDA-MB-231

2.6 Gab2蛋白表达降低后Akt/ARK5的磷酸化情况为研究Gab2在乳腺癌侵袭与转移中的信号通路，本实验采用10 μg·L－1EGF无血清培养基分别刺激各组细胞5、10 min，结果显示，EGF刺激后，Scr/MDA-MB-231细胞组Akt、ARK5的磷酸化增强;而SiGab2/MDA-MB-231细胞组中Akt、ARK5磷酸化明显受到抑制(Fig 5)。

Fig 5　Difference of phosphorylation of ARK5 and Akt induced by EGF in transfected MDA-MB-231 cells(Values represent gray value)

3　讨论

乳腺癌是严重危害女性健康的常见肿瘤，其发病率逐年升高，肿瘤的浸润与转移是患者死亡的主要原因，研究其发病机制，对于设计靶向阻断药物极为重要。

多项研究表明，Gab2是肿瘤相关蛋白，它的异常活化和表达促进肿瘤的发生、转移。Matsumura等［12］发现，Gab2在结肠癌组织中高表达，Gab2表达高的患者生存期明显低于低表达者。已有研究发现ARK5与MMP-2、MMP-9协同表达促进乳腺癌的侵袭转移［13］。本实验结果显示，乳腺浸润性导管癌中Gab2蛋白的表达明显高于癌旁正常乳腺组织，并且其表达与淋巴结转移、ER表达及组织学分期明显相关，与郑雄伟等［10］研究结果一致。同时检测到Gab2蛋白表达高的组织中伴有MMP-2、MMP-9蛋白表达增高，Gab2蛋白与MMP-2、MMP-9蛋白表达呈正相关。结果提示Gab2蛋白表达与乳腺癌的侵袭转移相关。

体外研究发现，乳腺癌细胞中Gab2蛋白表达高低与肿瘤细胞侵袭相关。Bocanegra等［14］将内源性Gab2基因沉默后，乳腺癌细胞系(SUM52，SUM44PE和MDA-MB-468)细胞周期分裂减缓，增殖及侵袭减弱，凋亡加快。Daly等［15］发现Gab2蛋白在乳腺癌细胞系(MCF-7、MDA-MB-361和MDAMB -453)中表达高于正常乳腺上皮细胞中表达。本实验Western blot检测结果显示，侵袭性强的MDA-MB-231细胞中Gab2蛋白表达高于侵袭性低的MCF-7细胞中表达。当采用小RNA干扰技术沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞中的内源性Gab2基因后，Western blot检测SiGab2/MDA-MB-231细胞组Gab2蛋白表达降低，同时伴有MMP-2、MMP-9蛋白表达也降低; Transwell检测结果显示，SiGab2/MDA-MB-231细胞组穿过人工基质膜的细胞数明显低于Scr/MDA-MB-231细胞组。以上结果提示，Gab2蛋白表达通过影响MMP-2、MMP-9蛋白的表达参与乳腺癌细胞的侵袭。

Gab2结构中含多个酪氨酸残基，可被酪氨酸磷酸化活化，之后招募下游多种蛋白分子，其中活化的Gab2可与PI3K的p85亚基结合，进而活化Akt等下游信号传导通路，参与肿瘤的侵袭、转移。Daly等［16］用HRGb1刺激乳腺癌MCF-7细胞后，发现酪氨酸磷酸化的Gab2明显增加，促进细胞的增殖。本实验在沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞中的Gab2后，用EGF刺激各组细胞5 min，Western blot检测结果显示，SiGab2/MDA-MB-231细胞组中Akt/ARK5的磷酸化明显受抑制。结果提示Gab2参与PI3K/Akt/ARK5信号传导通路。

综上所述，本实验证实Gab2在乳腺浸润性导管癌中高表达，Gab2参与PI3K/Akt/ARK5信号传导通路，进而影响MMP-2、MMP-9蛋白的表达促进乳腺癌的侵袭转移。因此，降低Gab2蛋白表达将有望成为控制乳腺癌侵袭转移的靶点。

参考文献:

［1］Stankovic S，Konjevic G，Gopcevic K，et al.Activity of MMP-2 and MMP-9 in sera of breast cancer patients［J］.Pathol Res Pract，2010，206(4):241－7.

［2］McCawley L J，Matrisian L M.Matrix metalloproteinases: multifunctional contributors to tumor progression［J］.Mol Med Today，2000，6(4):149－56.

［3］Foda H D，Zucker S.Matrix metalloproteinases in cancer invasion，metastasis and angiogenesis［J］.Drug Discov Today，2001，6(9):478－82.

［4］Ormandy C J，Musgrove E A，Hui R，et al.Cyclin D1，EMS1 and 11q13 amplification in breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2003，78(3):323－35.

［5］Bekri S，Adelaide J，Merscher S，et al.Detailed map of a region commonly amplified at 11q13－＞q14 in human breast carcinoma ［J］.Cytogenet Cell Genet，1997，79(1－2):125－31.

［6］Shi L，Sun X，Zhang J，et al.Gab2 expression in glioma and its implications for tumor invasion［J］.Acta Oncol，2013，52(8): 1739－50.

［7］Brown L A，Kalloger S E，Miller M A，et al.Amplification of 11q13 in ovarian carcinoma［J］.Genes Chromosomes Cancer，2008，47(6):481－9.

［8］Zatkova A，Schoch C，Speleman F，et al.GAB2 is a novel targetof 11q amplification in AML/MDS［J］.Genes Chromosomes Cancer，2006，45(9):798－807.

［9］孙磊，刘雨清，李小龙，等.Gab2-Akt-ARK5通路在胶质瘤侵袭中的研究［J］.中国肿瘤临床，2014，41(9):551－4.

［9］Sun L，Liu Y Q，Li X L，et al.Gab2-Akt-ARK5 signaling pathway is associated with theinvasion of glioma cells［J］.Chin J Clin Oncol，2014，41(9):551－4.

［10］郑雄伟，力超，刘健，等.Gab2在乳腺癌中的表达及其意义［J］.肿瘤学杂志，2010，16(9):715－7.

［10］Zheng X W，Li C，Liu J，et al.Expression of Gab2 in breast cancer and its significance［J］.J Oncol，2010，16(9):715－7.

［11］苏坚，周钰娟，廖前进，等.沉默LIMK1促进DADS抑制

SW480细胞迁移与侵袭［J］.中国药理学通报，2013，29(6): 760－6.

［11］Su J，Zhou Y J，Liao Q J，et al.Promotion of silence LIMK1 on diallyl disulfide inhibiting the migrationand invasion of human colon cancer SW480 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29(6): 760－6.

［12］Matsumura T，Sugimachi K，Takahashi Y，et al.Clinical significance of GAB2，a Scaffolding/Docking protein acting downstream of EGFR in human colorectal cancer［J］.Ann Surg Oncol，2014，21(Suppl 4): S743－9.

［13］姬静，张宝刚，张伟栋，等.ARK5与乳腺癌侵袭转移关系的研究［J］.临床与实验病理学杂志，2012，28(4):382－5.

［13］Ji J，Zhang B G，Zhang W D，et al.ARK5 is associated with the invasive and metastatic of breast carcinoma［J］.Chin J Clin Exp Pathol，2012，28(4):382－5.

［14］Bocanegra M，Bergamaschi A，Kim Y H，et al.Focal amplification and oncogene dependency of GAB2 in breast cancer［J］.Oncogene，2010，29(5):774－9.

［15］Daly R J，Binder M D，Sutherland R L.Overexpression of the Grb2 gene in human breast cancer cell lines［J］.Oncogene，1994，9(9):2723－7.

［16］Daly R J，Gu H，Parmar J，et al.The docking protein Gab2 is overexpressed and estrogen regulated in human breast cancer［J］.Oncogene，2002，21(33):5175－81.

Gab2 effects the invasion and metastasis of breast carcinoma through PI3K/Akt/ARK5/MMP signal pathway

TIAN Hong-yan1，CHEN Ping-ping1，LI Xiao2，LI Hong-li3，REN Tian-tian1，ZHANG Bao-gang1，YIN Chong-gao4，LIU Yu-qing1
(1.Dept of Pathology，2.College of Biological Science and Technology，3.Medicine Research Center，4.College of Nursing，Weifang Medical University，Weifang Shangdong 261053，China)

Abstract:Aim To investigate the molecular mechanism of Gab2 in the invasion and metastasis of breast cancer and provide a theoretical basis for clinical prevention of breast cancer invasion and metastasis.

Methods The Gab2，MMP-2 and MMP-9 expressions in 80 cases of breast cancer were detected by immunohistochemistry.Western blot was used to detect the expression of Gab2 protein in MDA-MB-231 cells and MCF-7 cells.The siRNA plasmid was used to transfect MDA-MB-231 cells.Western blot was used to detect the proteins expression of Gab2，MMP-2 and MMP-9.Transwell in vitro experiment was used to detect the invasion ability of each group transfected MDA-MB-231 cells，Western blot was used to analyze phosphorylation of Akt and ARK5 induced by epithelial growth factor(EGF)in transfected cells(SiGab2/MDA-MB-231 and Scr/MDA-MB-231).Results The expression of Gab2 protein in invasive ductal carcinoma was significantly higher than in normal breast tissue(P＜0. 01).The expression of Gab2 was dramatically correlated with lymph node metastasis，ER expression，tumor histological grade，MMP-2 and MMP-9(P＜0. 05).The expression of Gab2 protein in MDA-MB-231 cells was higher than in MCF-7 cells.The expression of Gab2，MMP-2 and MMP-9 decreased in SiGab2/MDA-MB-231 cells and the invasion ability of SiGab2/MDA-MB-231 cells was significantly decreased(P＜0. 05)，and after 5 minutes’stimulating by EGF，the phosphorylation of Akt and ARK5 was significantly reduced.Conclusion Gab2 can promote the invasion and metastasis of breast cancer by effecting the expression of MMP-2 and MMP-9 through PI3K/Akt/ARK5 signal pathway.

Key words:breast carcinoma; Gab2; Akt; ARK5; MMP; invasion; metastasis

作者简介:田红艳(1989－)，女，硕士，研究方向:肿瘤病理学，E-mail: tianhongyan0413@163.com;

基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(No 81402389);山东省自然科学基金(No ZR2014HL077);山东省高等学校科技计划(No J12LK03，J13LK03);国家级大学生创新训练计划项目(No 201410438003);潍坊市科技计划项目(No 201302089);潍坊医学院大学生科技创新基金(No KX2014033)

收稿日期:2015－03－12，修回日期:2015－04－02

文献标志码:A

文章编号:1001－1978(2015)07－1014－05

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.025