肿瘤抑制因子p96蛋白在小鼠内耳毛细胞的表达△

陈知己 蔡婷 宋锐 顾翔 周小清 袁伟



·基础研究·

肿瘤抑制因子p96蛋白在小鼠内耳毛细胞的表达△

陈知己 蔡婷 宋锐 顾翔 周小清 袁伟

目的 研究肿瘤抑制因子p96蛋白在昆明小鼠内耳毛细胞的定位表达特点。方法 采用间接免疫荧光法标记耳蜗基底膜并铺片，激光共聚焦显微镜分层扫描观察p96蛋白的表达定位。结果 内、外毛细胞中均可观察到p96蛋白荧光标记，且该蛋白在毛细胞胞质中的表达并不均匀。在内毛细胞胞质中，细胞顶部表皮板及附近胞质区有类圆形的P96蛋白高表达区。结论 肿瘤抑制因子p96蛋白表达于内、外毛细胞，在内毛细胞顶区有着显著的局部高表达特征。结合该蛋白的生理功能，推测内毛细胞顶区可能是囊泡内吞、物质交换的一个重要亚细胞部位。(中国眼耳鼻喉科杂志，2015，15：315-317)

抑癌基因；毛细胞；听力；p96蛋白；表达

抑癌基因的研究已有众多体系，这类基因的表达强弱直接控制细胞的增殖过程。基因结构突变或者异常表达甚至可导致肿瘤发生。在正常细胞中，它们转录表达各种因子，调控细胞的生长分化、物质交换和信号转导等生命活动[1]。内毛细胞的信号转导异常直接影响带状突触的功能，改变稳定高效的听信号“机械-电”传导活动。然而受到内毛细胞本身特点的限制，关乎其信号转导与功能学关系的研究甚少。p96蛋白为具有信号转导功能的磷蛋白之一，其基因Dab2/DOC-2(disable2/deletion in ovarian carcinoma-2)为肿瘤抑制基因。p96蛋白为该基因家族成员之一，据报道其和卵巢癌的发生有重要联系；近来的分子拓展研究发现，该蛋白还参与细胞内多条信号通路、囊泡内吞、蛋白及受体转运等过程，进而调控细胞分化发育及功能代谢[2]。本课题组拟从生理状态下成年小鼠p96表达定位及分布规律展开初步研究，为日后病理模型下蛋白分布研究及信号通路与内毛细胞功能相关性的探究作一个铺垫。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验用9周龄SPF(无特定病原体级)昆明小鼠，购买于第三军医大学动物中心，雌雄不限，耳廓反射灵敏，排除中耳及内耳疾病。

1.2 实验试剂 p96抗体(抗Dab2蛋白661-770氨基酸区段制成，H-110，兔抗鼠，Santa Cruz公司)，毛细胞特异性分子肌球蛋白6(Myosin 6)抗体(K-20，羊抗鼠，Santa Cruz公司),一抗1∶50磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)稀释，Green-conjugated IgG(驴抗羊，Abbkine公司)1∶250稀释，Red-conjugated IgG(驴抗兔，Abbkine公司)1∶500稀释，Dapi染料(4′6-二脒基-2-苯基吲哚，Sigma公司)1∶200稀释，0.3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)溶液，0.01 mmol/L PBS，0.3% Triton溶液，4%多聚甲醛溶液，抗荧光淬灭封片液(重庆博培公司)，指甲油。

1.3 实验方法

1.3.1 制备耳蜗基底膜 用颈椎脱臼法处死小鼠，剪刀断头后，从枕骨大孔处开始沿正中线剪开颅骨。去除脑组织后，暴露耳蜗及颞骨听泡，用剪刀分离耳蜗，去除周围的肌肉与筋膜，置于培养皿中。用镊子轻轻在蜗顶处挑出一小孔，并同时开放圆窗及卵圆窗，用1 mL注射器分别经圆窗、卵圆窗及蜗顶小孔灌注4%多聚甲醛溶液，反复3次后，将耳蜗置于盛有4%多聚甲醛溶液的EP管中，4 ℃固定过夜。然后取出耳蜗置于0.01 mmol/L PBS中，从底回开始用显微镊逐步剥除蜗壳骨质，暴露并分离耳蜗基底膜中间回，清除前庭膜、盖膜及血管纹。

1.3.2 间接法免疫荧光标记基底膜 PBS漂洗2遍→0.3% Triton×100通透15 min→PBS漂洗3遍→0.3%BSA室温封闭2 h→吸干后分别加入一抗，4 ℃过夜→PBS漂洗3次→分别加入相应的荧光二抗，37 ℃孵育40 min→PBS漂洗3次→抗荧光淬灭剂封片→压片→盖玻片周围涂以指甲油→4 ℃冰箱湿润片盒中保存(PBS漂洗每遍5 min)。

1.3.3 激光共聚焦显微镜分层扫描 在激光共聚焦显微镜(40倍油浸物镜，AxioObserver LSM780，ZEISS)下观察及拍照。激发光波长：二抗驴抗羊488 nm，驴抗兔591 nm。Dapi定位内毛细胞核之后，分层扫描、连续观察各层图像。扫描层厚为2 μm。

2 结果

在耳蜗基底膜上，3排外毛细胞排列在靠血管纹一侧，而1排内毛细胞排列在靠蜗轴一侧。为了显示出耳蜗毛细胞形态及大小，从而确定p96蛋白在基底膜上的大致表达部位，另外对Myosin6做了免疫荧光染色。染色发现，Myosin6仅表达于内、外毛细胞区域，内、外毛细胞胞质及外毛细胞纤毛等部位都被免疫荧光着色(绿色)。与此同时，通过对比发现，p96蛋白也表达于内、外毛细胞区域，并且毛细胞胞质中，p96蛋白表达并不均匀，尤其在内毛细胞顶部(apical area)存在着强表达区域(图1中粗箭头所示圆形区域)。对比图2中Myosin6的表达图像，认为这一高表达区域可能是表皮板及靠近其的细胞顶区胞质。

图1. p96蛋白在内毛细胞的表达(红色示该蛋白免疫荧光，粗箭头示圆形强表达区) 图2. 毛细胞特异性分子Myosin6的表达(绿色示该蛋白免疫荧光) 蓝色为Dapi标记细胞核，OHC为外毛细胞，IHC为内毛细胞，标尺20 μm

3 讨论

Dab2基因为果蝇属Disabled之一，因其在卵巢癌细胞株中发生表达缺失，1994年被Mok等命名为卵巢缺失基因(DOC-2)[3]。人Dab2/DOC-2基因定位于染色体5p13.1，编码p96、p67蛋白亚型。鼠的Dab2基因表达于15号染色体上，编码p96、p93和p67剪接体亚型[4]。本文一抗由来源于抗Dab2蛋白661-770氨基酸区段的抗体制成，氨基酸序列分析表明其来源于p96蛋白部分区段。有研究[5]发现，人与鼠之间该亚型具有81%的同源性，故研究鼠p96蛋白功能对研究该蛋白在人体疾病中的分子机制有着一定的现实意义。

Dab基因家族表达为2类，分别是Dab1和Dab2。哺乳动物中Dab1主要表达于神经系统中，对神经元的定位、分化、迁移有着重要的作用。Dab2为一种新型的抑癌基因，正常表达于脾、卵巢上皮细胞、前列腺、胸腺、乳腺、小肠绒毛等组织细胞中[6]。有关Dab2基因生理功能的研究发现，其涉及调控胞内Ras/MAPK、转化生长因子-β(TGF-β)、Wnt通路的信号级联转导、蛋白受体向胞内的转运以及细胞内吞等过程[2]。p96蛋白为Dab2基因表达的亚型之一，在耳蜗中的功能表达并不清楚，但通过生理作用分析，发现其很有可能与内毛细胞的功能有关。我们通过免疫荧光染色发现该蛋白在内耳毛细胞中存在极性表达特征，并且与内吞较活跃的肾小管上皮细胞及肠上皮细胞中该蛋白的表达特征相似。这也说明内耳毛细胞可能存在与内环境进行高效物质交换的分子机制。

表达定位研究是本课题组后期针对毛细胞功能调控研究的一个基础。内毛细胞担负着听信号“机械-电”传导活动，功能十分活跃，故内毛细胞囊泡内吞、蛋白转运、受体调节机制至关重要。有研究[7]发现，该蛋白通过募集Myosin6，调控着网格蛋白介导内吞(clathrin mediated endocytosis,CME)过程。内毛细胞囊泡存在CME过程。通过本实验，我们发现内毛细胞顶部表皮板及附近胞质区有着类圆形的p96蛋白高表达区，这与内毛细胞CME内吞部位密切相关。对于内毛细胞功能来讲，CME不仅关乎囊泡回收、膜稳定，同时也是胞外物质入胞、质膜受体内化的重要机制之一。对内毛细胞CME过程进行实验干预，探讨其对内毛细胞形态功能的影响也是本课题组后续研究方向。

除了作为调控信号通路的磷蛋白，p96蛋白本质上也是一种衔接蛋白，它与质膜低密度脂蛋白受体(LDLR)衔接可以介导蛋白和类脂吸收入细胞。兆蛋白(megalin)就是p96蛋白所衔接的其中一种质膜受体。有研究[8]发现，megalin基因的多态性与个体对顺铂耳毒性的敏感性有关[9]。因此，明确p96蛋白这一衔接蛋白在耳蜗毛细胞表达定位具有意义，说明内毛细胞顶部可能是物质交换甚至各种药物入胞的重要部位。

此外，近年来Wnt信号通路在内耳发育功能调控方面的研究成为一项热点，其决定了听基板、听囊、内耳上皮细胞等内耳重要结构的发育和形成。该通路异常将导致内耳结构发育异常，影响功能成熟[10-11]。p96蛋白处于Wnt通路的关键位置，可以通过多个环节对该通路的效应产生抑制[2]。本实验通过与毛细胞标记分子myosin6荧光图像对比分析，初步证实p96蛋白表达于耳蜗毛细胞，且在内毛细胞顶区存在局部高表达区域，但这一结论仅仅处于表达层面，尚不能证实p96蛋白在内毛细胞中发挥功能，更不能简单地将其他细胞中该蛋白的功能研究套用至毛细胞研究中。在后续研究中，我们将优化实验条件，完成蛋白双标图片及耳蜗免疫共沉淀实验，从而明确蛋白在毛细胞的相互作用关系，深入探讨年龄相关性蛋白表达变化及通过功能调控实验分析该蛋白在毛细胞的功能。我们推测囊泡内吞、物质交换、发育再生等3个方面可能成为未来研究内毛细胞中该蛋白功能的新方向。

p96蛋白表达于多种细胞，内毛细胞中该蛋白极性表达特征与小肠微绒毛区及肾小管上皮细胞中的表达特征相似，这也印证了毛细胞功能十分活跃。结合其在细胞分化、信号转导、物质运输、囊泡内吞中的重要作用，围绕内毛细胞p96蛋白功能的研究存在众多不同的方向。研究者可能从中发现毛细胞再生、分化、功能维持及物质交换新的机制，这些机制或许会为感音神经性聋的治疗提供新的参考。

[ 1 ] Lobry C,Oh P,Mansour MR,et al.Notch signaling:switching an oncogene to a tumor suppressor[J].Blood,2014,123(16):2451-2459.

[ 2 ] 曾浪，孙雪.Dab2/DOC-2基因的研究进展[J].当代医学，2011,17(24):19-21.

[ 3 ] Mok SC,Wong KK,Chan RK,et al.Molecular cloning of differentially expressed genes in human epithelial ovarian cancer[J].Gynecol Oncol,1994, 52(2):247-252.

[ 4 ] 邵淑丽，蔡昱.Disabled-2基因与肿瘤的相关研究[J].中国癌症杂志，2005,15(3):302-305.

[ 5 ] Mok SC,Chan WY,Wong KK,et al.DOC-2, a candidate tumor suppressor gene in human epithelial ovarian cancer[J].Oncogene,1998,16(18):2381-2387.

[ 6 ] Martin JC,Herbert BS,Hocevar BA,et al.Disabled-2 downregulation promotes epithelial-to-mesenchymal transition[J].Br J Cancer,2010,103(11):1716-1723.

[ 7 ] Tumbarello DA,Kendrick-Jones J,Buss F.Myosin VI and its cargoadaptors-linking endocytosis and autophagy[J].J Cell Sci,2013,126(Pt 12):2561-2570.

[ 8 ] Riedemann L,Lanvers C,Deuster D,et al.Megalin genetic polymorphisms and individual sensitivity to the ototoxic effect of cisplatin[J]. Pharmacogenomics J,2008,8(1):23-28.

[ 9 ] Schacht J,Talaska AE,Rybak LP.Cisplatin and aminoglycoside antibiotics: hearing loss and its prevention[J].Anat Rec(Hoboken),2012,295(11):1837-1850.

[10] Munnamalai V,Fekete DM.Wnt signaling during cochlear development[J].Semin Cell Dev Biol,2013,24(5):480-489.

[11] 陈志婷，张小兵.Wnt信号通路与内耳发育调控[J].听力学与言语疾病杂志,2012,20(1):56-59.

(本文编辑 杨美琴)

Expression of p96 in the inner ear hair cells in mice

CHENZhi-ji,CAITing,SONGRui,GUXiang,ZHOUXiao-qing,YUANWei.
DepartmentofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery,SouthwestHospitaloftheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China

YUAN Wei, Email: weiyuan175@sina.com

Objective To investigate the expression of tumour suppressor, p96, in the cochlear hair cells in Kunming mice. Methods The basilar membrane of mice cochlea was immuno-double labeled with antibody and Dapi. The distribution of p96 was detected by immunofluorescence staining and laser scanning confocal microscope. Results P96 was expressed in the inner and outer hair cells of cochlea and was especially strong in the inner hair cells at the apical area. This area ought to be the cuticular plate and the nearby cytoplasma. Conclusions The expression of tumor suppressor, p96, displayed a prominent polarised characteristics which may be similar to the expression of polarised epithelial cells. The cuticular plate and the nearby cytoplasma of inner hair cells maybe a key subcellular site related to the differentiation and metabolism of cells.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:315-317)

Genes, tumor suppressor; Hair cells; Auditory; p96; Expression

国家自然科学基金(81470694;81271080;30973301)；重庆市自然基金(CSTC2009BB5170);第三军医大学基金(2010XLC06)

第三军医大学附属西南医院耳鼻咽喉头颈外科 重庆 400038

袁伟(Email：weiyuan175@sina.com )

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.05.004

2015-01-22)