康柏西普对人视网膜Müller细胞生长和水通道蛋白4表达的影响

陈年均 李明新



·基础研究·

康柏西普对人视网膜Müller细胞生长和水通道蛋白4表达的影响

陈年均 李明新

目的 探讨新型抗血管内皮生长因子(VEGF)康柏西普注射液对视网膜Müller细胞生长和水通道蛋白4(AQP4)表达的影响。方法 将培养的人视网膜Müller细胞分为5组：正常对照组、高糖组(25 mmol/L葡萄糖)和药物组(给予低剂量0.25 μg/mL、中剂量2.5 μg/mL、高剂量25 μg/mL的康柏西普)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中VEGF的分泌情况，采用CCK8法和流式细胞术检测细胞生长情况，采用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法检测AQP4的表达情况。结果 康柏西普显著抑制了高糖状态下Müller细胞VEGF的分泌，但对高糖处理引起的Müller细胞活力下降并无明显改善；康柏西普明显抑制了高糖诱导的Müller细胞AQP4表达增加，并呈剂量依赖性。结论 康柏西普是一种高效的VEGF拮抗剂，可以通过降低Müller细胞AQP4的表达缓解视网膜水肿，但对Müller细胞本身的生长并无影响。(中国眼耳鼻喉科杂志，2015，15：318-323)

康柏西普；Müller细胞；水通道蛋白4；视网膜水肿

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病眼病不可逆盲的最严重并发症，是50岁以上患者重要的致盲原因，在西方则成为首要致盲原因[1]。而视网膜水肿是DR的最常见并发症之一。国内一项调查显示：我国糖尿病患者日渐增多，而糖尿病患者中DR的患病率高达44%～51.3%[2]。近年来有研究[3]发现，DR患者眼内尤其是玻璃体腔内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)含量增高是DR发展、恶化的关键原因。内源性VEGF还作用于许多非血管性细胞，如视网膜Müller细胞和光感受器细胞，并对视功能具有保护作用[4]。Müller细胞是视网膜内最主要的神经胶质细胞，在糖尿病患者和动物模型视网膜病理过程中反应性激活[5-9]。DR在早期新生血管形成之前，就出现VEGF表达增加[5-10]，这种VEGF的增加主要是由视网膜Müller细胞分泌[11]。

水通道蛋白(aquaporin，AQP)又名水孔蛋白，是一种位于细胞膜上的蛋白质(内在膜蛋白)，在细胞膜上组成“孔道”，可控制水在细胞的进出。目前已知哺乳类动物体内的AQP有13种。AQP4是一种双向跨膜转运蛋白，主要表达在血管周围Müller细胞终板膜和内界膜内。最近的研究[12-13]发现，在许多缺氧、缺血视网膜病，如DR、视网膜静脉阻塞中，存在AQP4异常表达，这表明AQP4与视网膜水肿相关。

康柏西普(conbercept)是我国首个自主研发的眼用抗VEGF注射液，临床上用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性(wet age-related macular degeneration, wAMD)，效果显著[14-17]。国外同类的抗VEGF药物(如贝伐单抗、雷珠单抗)均可用于治疗wAMD和DR引起的视网膜水肿[18]。然而，康柏西普是否也能应用于DR引起的视网膜水肿目前尚罕见相关报道。本课题拟以体外培养的人视网膜Müller细胞为研究对象，初步探讨康柏西普对Müller细胞生长和AQP4表达的影响，旨在为康柏西普用于治疗DR引起的视网膜水肿提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人视网膜Müller细胞(上海力湃生物科技有限公司)，康柏西普(成都康弘生物科技有限公司)，DMEM、DMEM/HIGH GLUCOSE[赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司]，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Gibco公司)，CCK8试剂盒(北京利维宁生物科技有限公司)，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)，Trizol(北京TIANGEN公司)，反转录试剂盒(北京TIANGEN公司)，AQP4单克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，HRP标记的二抗(Millipore公司)。

1.2 方法 ELISA：将培养处于指数生长期的Müller细胞，随机分为正常对照组、高糖组(25 mmol/L)、药物处理组。药物处理组给予不同浓度的康柏西普，又分为低剂量(0.25 μg/mL)、中剂量(2.5 μg/mL)和高剂量(25 μg/mL)。48 h后吸取细胞上清液，3 000×g离心15 min，取上清液，应用ELISA检测不同剂量的康柏西普对Müller细胞VEGF分泌水平的影响。

CCK8：调整Müller细胞密度，以1×105/孔接种于96孔培养板。培养2 d后，按上述分组处理细胞，每组设5个复孔。继续培养24、48 h后，每孔用培养基洗3次，加入100 μL CCK8，混匀后置于培养箱内继续培养2～3 h，采用全自动酶标免疫在450 nm处检测各孔吸光度值。

流式细胞术：将细胞按1×105～2×105个/mL的细胞密度2 mL接种于六孔板中，在6～12 h细胞贴壁后，按上述分组加入相应的含血清培养基2 mL，再过48 h后，消化、离心收集细胞，采用FITC和PI双染法检测细胞凋亡情况。

半定量反转录聚合酶链反应(reverse transcriptional polymerase chain reaction, RT-PCR)：总RNA的提取参照Trizol说明书，依照紫外分光光度仪测定A260∶A280比值，重复3次，测得该比值稳定于1.8～2.0，计算总RNA浓度。按反转录试剂盒说明书制备cDNA模板。RT-PCR：以正常对照组和各个实验组Müller细胞第1链2 μL cDNA为模板，应用AQP4特异性引物(上游：5′-GGAATTTCTGGCCATGCTTA-3′；下游：5′-AAGACAGACTTGGCGATGCT-3′)进行PCR扩增，每个反应体系中均以β-actin作为内参。PCR条件为：94 ℃预变性3 min，然后94 ℃变性30 s，60 ℃退火延伸45 s，循环28次，最后72 ℃总延伸7 min。以2%琼脂糖凝胶电泳检测AQP4扩增产物(231 bp)和β-actin扩增产物(240 bp)，将凝胶置凝胶成像系统摄像、分析。实验重复3次。

Western印迹法：提取正常对照组和各个实验组中Müller细胞总蛋白，采用紫外分光光度仪测定蛋白含量。各组取30 μg总蛋白，加入4×SDS上样缓冲液(含10%β-巯基乙醇)，于沸水中加热5 min，行SDS-PAGE(分离胶浓度为10%)。电泳结束后，进行湿式电转移。转移后的PVDF膜(Millipore公司)，用含10%脱脂奶粉的TBST(含0.5%Tween-20)缓冲液室温包被2 h；然后用抗AQP4抗体(1∶500)室温孵育1 h后，4 ℃过夜；TBST漂洗5 min×5次，转入HRP-抗兔IgG(1∶2 000)中；室温孵育2 h，TBST漂洗5 min×5次，ECL发光、显影、定影。实验重复3次。半定量分析通过测定目的条带的吸光度值(A值)及β-actin吸光度值(a)，并计算(A/a) × 100%，定义为AQP4蛋白表达相对百分比(relative percentage)。

1.3 统计学处理 数据以均值±标准差表示，采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用LSD检验，检验水准取α=0.05，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 康柏西普对Müller细胞VEGF分泌的影响 应用ELISA检测细胞上清液中VEGF的浓度，标准曲线如图1A所示，R2=0.998。高糖(25 mmol/L葡萄糖)培养的Müller细胞引起VEGF分泌增加(P<0.001)。低剂量(0.25 μg/mL)、中剂量(2.5 μg/mL)和高剂量(25 μg/mL)康柏西普显著降低了Müller细胞VEGF的分泌(图1B，P< 0.001)，表明康柏西普是Müller细胞分泌VEGF的高效拮抗剂。

图1. ELISA检测康柏西普处理Müller细胞对VEGF分泌的影响 A.标准曲线，R2=0.998；B.VEGF检测结果，#与正常对照组比较(P<0.001)，**示与高糖组比较(P<0.001)

2.2 康柏西普对Müller细胞活力的影响 如图2所示，高糖处理后，Müller细胞活力明显下降(P=0.011)，但低剂量(0.25 μg/mL)、中剂量(2.5 μg/mL)和高剂量(25 μg/mL)剂量康柏西普并未引起Müller细胞活力的明显改变(P>0.05)，提示康柏西普对Müller细胞增殖或凋亡无显著影响。进一步应用流式细胞术检测细胞凋亡显示：高糖引起Müller细胞凋亡百分比明显增加(P=0.011)，但低剂量(0.25 μg/mL)、中剂量(2.5 μg/mL)和高剂量(25 μg/mL)康柏西普并未引起Müller细胞凋亡的显著改变(P>0.05)(图3)。

图2. CCK8法检测康柏西普对Müller细胞活力的影响 #示与正常对照组比较(P= 0.011)，但康柏西谱并未引起高糖状态下Müller细胞活力的明显改变(P>0.05)

图3. 流式细胞术检测康柏西普对Müller细胞凋亡的影响 A.正常对照组；B.高糖；C、D、E分别为康柏西普低剂量(0.25 μg/L)、中剂量(2.5 μg/L)和高剂量(25 μg/L)组；F.细胞凋亡率结果；#示与正常对照组比较(P=0.001)；但不同剂量的康柏西普并未引起高糖状态下Müller细胞凋亡率的明显改变(P>0.05)

2.3 康柏西普对Müller细胞表达AQP4-mRNA水平的影响 在正常对照组和各实验组中，采用RT-PCR法检测AQP4在基因水平的表达变化(图4A)，对其进行半定量分析发现，高糖引起AQP4-mRNA表达增加(P=0.024)，低剂量(0.25 μg/mL，P<0.01)、中剂量(2.5 μg/mL，P<0.01)和高剂量(25 μg/mL，P<0.001)康柏西普分别不同程度地逆转了高糖诱导的AQP4-mRNA表达上调(图4B，P<0.01)。

2.4 康柏西普对Müller细胞表达AQP4蛋白水平的影响 在对照组和各实验组中，采用Western 印迹法检测AQP4在蛋白水平的表达变化(图5A)，对其进行半定量分析发现，高糖引起AQP4表达增加(P=0.001)，低剂量(0.25 μg/mL，P=0.01)、中剂量(2.5 μg/mL，P<0.001)和高剂量(25 μg/mL，P<0.001)康柏西普分别不同程度地逆转了高糖诱导的AQP4表达上调(图5B)。

图4. 半定量RT-PCR检测康柏西普处理Müller细胞对AQP4-mRNA水平的影响 A.泳道1为正常对照组，2为高糖，3、4、5分别是康柏西普低剂量(0.25 μg/mL)、中剂量(2.5 μg/mL)和高剂量(25 μg/mL)组，β-actin为上样对照；B.半定量结果，#示与正常对照组比较(P= 0.024)，与高糖组比较(*示P< 0.01，**示P< 0.001)

图5. Western印迹法检测康柏西普处理Müller细胞对AQP4水平的影响 A.泳道1为正常对照组，2为高糖，3、4、5分别是康柏西普低剂量(0.25 μg/mL)、中剂量(2.5 μg/mL)和高剂量(25 μg/mL)组，β-actin为上样对照；B.半定量结果，#为与正常对照组比较(P= 0.001)，与高糖组比较(*示P=0.01，**示P< 0.001)

3 讨论

DR引起的黄斑水肿是DR最常见的表现形式之一。眼内新生血管生成是DR病情发展的重要标志，VEGF及其受体在新生血管生成、血管分化及增加通透性等方面起重要作用[19]。

视网膜从组织来源与大脑相同，是一个高级的神经组织。近年来大量研究证明，胶质细胞直接参与视网膜的发育、稳态维持、功能调节和视网膜相关疾病的发生及发展[20]。Dubois-Dauphin等[21]在小鼠实验中，通过诱导Müller细胞凋亡导致神经元凋亡和视网膜变性。Müller细胞的增生常发生在血-视网膜屏障(BRB)破坏之后，进一步加剧血管功能障碍[5-6]。Müller细胞的增生可能是由于氧化应激和多元醇通路的激活而启动，因为这些通路的药理学抑制剂阻断了中间丝蛋白胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)的上调[22-23]。在糖尿病患者和动物模型的研究中均发现，Müller细胞数目增加以及功能活化[5-9]。此外，在DR中，Müller细胞也表现出神经递质摄取和代谢失调[6, 24]，如在糖尿病患者和动物模型的玻璃体和视网膜中检测到谷氨酸浓度增加[6, 24]。过多的谷氨酸可能是糖尿病患者、动物中视网膜电流下降和神经节细胞凋亡的主要原因。

康柏西普是一种抗VEGF的融合蛋白，可以抑制病理性血管生成。2013年12月4日国家食品药品监督管理总局官网分布批准康柏西普眼用注射液用于治疗wAMD。该药物系一种VEGF受体与人免疫球蛋白Fc段基因重组的融合蛋白，通过结合VEGF，竞争性抑制VEGF与受体结合并阻止VEGF家族受体激活，从而抑制内皮细胞增殖和血管新生，达到治疗wAMD的目的。通过近期临床应用的观察，康柏西普对于wAMD的治疗效果显著。

由于康柏西普相关的基础研究报道尚未查到，本实验所选的药物剂量和时间参照同类抗VEGF药物贝伐单抗、阿柏西普、雷珠单抗的实验确定的[25-28]。高糖可以刺激Müller 细胞培养上清液中VEGF含量增加，提示高糖对于Müller细胞中VEGF分泌具有调控作用。孙雅彬等[29]研究发现，高糖可以促进Müller细胞VEGF表达增加。这些研究提示，高糖能够促进Müller细胞VEGF的表达和分泌。我们发现，康柏西普处理显著抑制了Müller细胞VEGF的分泌，并呈浓度依赖性。0.25 μg/mL的康柏西普处理使Müller细胞的VEGF水平降低了20倍之多，提示康柏西普是VEGF受体的高效拮抗剂。这可能是由于康柏西普与贝伐单抗、雷珠单抗等VEGF拮抗剂不同，它不仅作用于VEGF受体-1(VEGFR-1)，而且作用于VEGFR-2[15]。

Müller细胞和视网膜色素上皮细胞是介导视网膜组织内水转运的主要细胞。AQP可控制水在细胞的进出。AQP4是一种双向跨膜转运蛋白，主要表达在血管周围Müller细胞终板膜和内界膜之内。近年来有研究发现，在DR、视网膜静脉阻塞等水肿的视网膜中出现AQP4异常分布，AQP4在视网膜Müller细胞上，尤其是在玻璃体旁和环绕血管内皮的Müller细胞足突上呈高表达。Da等[30]发现，AQP4基因缺失鼠比正常鼠视网膜水肿程度轻、损伤小，认为AQP4参与视网膜水肿的发生。我们的研究发现，康柏西普处理高糖状态下的Müller细胞明显抑制了AQP4-mRNA和蛋白水平的表达，这与蔡维[27]和曾苗等[31]应用贝伐单抗的研究结果一致。此外，高剂量的康柏西普(25 μg/mL)甚至会使高糖状态下Müller细胞AQP4-mRNA和蛋白水平的表达降低至正常状态以下，提示在临床上应用康柏西普治疗时剂量不宜太高，但有趣的是，这一剂量并没有引起Müller细胞活力的显著改变。

康柏西普能否用于糖尿病性视网膜水肿，目前罕见相关报道。我们建立了高糖Müller细胞模型来研究新型VEGF拮抗剂对Müller细胞功能的影响，旨在为临床用药提供一定的实验依据。康柏西普对高糖状态下的Müller细胞显著抑制了VEGF的分泌，但对高糖处理引起的Müller细胞活力下降并无明显改善。康柏西普处理明显抑制高糖诱导的Müller细胞AQP4表达增加，并呈剂量依赖性，提示康柏西普可能通过降低Müller细胞AQP4的表达来缓解视网膜水肿。

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(本文编辑 诸静英)

·学术动态·

第八届亚洲神经眼科大会暨第四届全国神经眼科学术会议通知

亚洲神经眼科协会(ASNOS)于2002年在日本东京成立。由亚洲神经眼科协会每两年主办一次的亚洲神经眼科大会是一个大型国际神经眼科会议，代表了亚洲神经眼科基础研究及临床研究最高水平。历届会议都有数百名各国神经眼科专业人士进行学术交流，对国际最近神经眼科新技术及学术前沿进行介绍及讨论。亚洲神经眼科大会提供了一个国际化平台, 让世界各地的参会者对前沿的神经眼科研究课题交流想法, 探讨最新进展及促进未来的合作。在亚洲神经眼科大会中一个尤其出名且重要的病例讨论版块WalshinAsia，选取各国出色的带病理结果的病例进行深入剖析,非常具有挑战性。

第八届亚洲神经眼科大会暨第四届全国神经眼科学术会议将于2015年10月22～25日在中国北京召开。本次会议将邀请国内外著名的神经眼科、眼科、神经内科及神经外科等专家到会，就神经眼科疾病在诊断学、遗传学、影像学、流行病学、低视力康复等研究领域作专题介绍及神经眼科病例讨论。

此次会议是对我国神经眼科的一次检阅，也是与国际神经眼科医师交流学习的机会，欢迎全国医师踊跃投稿参会。大会网址：www.2015asnos.com；大会邮箱：info@2015asnos.com；大会联系人: 王京凤13910114145，赖梦莹18600288822。

热忱期待您的参与！

第八届亚洲神经眼科大会组委会

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院第三届神经眼科培训班通知

第三届复旦大学附属眼耳鼻喉科医院神经眼科学习班将在十月金秋隆重举办，负责主办这次学习班的王敏教授再次有幸邀请到美国爱荷华大学神经眼科主任RandyKardon教授前来参加，还邀请到北京协和医院眼科钟勇教授，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院放射科沙炎教授，眼科钱江教授、田国红教授和复旦大学附属华山医院神经内科周磊医生参与授课。本次内容包括视神经炎的诊治与鉴别诊断、眼肌型重症肌无力的诊疗策略、视乳头疾病的诊治思路、瞳孔测量仪在神经眼科的应用、相干光断层扫描(OCT)血管成像在神经眼科的应用、神经眼科疾病常见的OCT改变、眼眶疾病与神经眼科和非动脉炎性前段缺血性视神经病变专家共识等。学习班将继续秉承既往两届学习班的实用性，深入浅出地为学员带来神经眼科的最新资讯，结合病例讨论和现场互动，为各位同仁带来不一样的头脑风暴。让一切变得简单明了，神经眼科不再神秘，这个秋天诚邀各位同仁再度聚首在复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，一同享受这囊括了神经眼科、神经内科和放射科的知识盛宴。会议地点：复旦大学附属眼耳鼻喉科医院门诊6楼第二会议室；会议时间：2015年10月16～17日；会议开始时间：10月16日8:30。本次培训班不收取培训费，会议免费提供午餐。联系人：陆萍老师；电话64377134-706。

王敏

Effects of conbercept on the growth of retinal Müller cells and the expression of aquaporin-4

CHENNian-jun,LIMing-xin.
DepartmentofOphthalmology,theAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221000,China

LI Ming-xin, Email: lmx216@vip.sina.com

Objective To investigate the effects of conbercept, a new vascular endothelial growth factor (VEGF) antagonist, on the growth of retinal Müller cells and the expression of aquaporin-4 (AQP4). Methods The cultured Müller cells were divided into 5 groups: normal control group, high glucose group (25 mmol/L glucose) and high glucose with conbercept treating groups at low (0.25 μg/mL), middle (2.5 μg/mL) and high (25 μg/mL) dose of conbercept treatment. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to investigate the VEGF secretion in the cell supernatant; CCK8 and flow cytometry were used to assess the cell growth; and semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and Western blot were used to detect the AQP4 expression. Results Conbercept treatments significantly inhibited the VEGF secretion of Müller cells under high glucose, but it did not rescue the high glucose-induced growth inhibition of Müller cells. Conbercept significantly reduced the increases of AQP4 expression in Müller cells that induced by high glucose treatment at a dose-dependent manner. Conclusions As a high-potent anti-VEGF drug, conbercept may alleviate retinal edema by down-regulating AQP4 expression, with no remarkable effects on Müller cell growth.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:318-323)

Conbercept; Müller cell; Aquaporin-4; Retinal edema

徐州医学院附属医院眼科 徐州 221000

李明新(Email:lmx216@vip.sina.com)

为徐州医学院研究生院的在读研究生、住院医师 徐州 221000

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.05.005

2015-02-07)