大熊猫源双歧杆菌分离株的培养特性及药敏试验

杨慧萍，马清义，高　睿（.杨凌职业技术学院，陕西杨凌700；.陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心，陕西周至7040）



大熊猫源双歧杆菌分离株的培养特性及药敏试验

杨慧萍1，马清义2，高睿1
（1.杨凌职业技术学院，陕西杨凌712100；2.陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心，陕西周至710402）

摘 要：双歧杆菌的培养特性和药敏试验是研究双歧杆菌微生态制剂的基础。从大熊猫新鲜粪便中分离的两株双歧杆菌进行细菌培养、药敏试验及耐温驯化等研究发现，改良肉汤培养基是双歧杆菌大熊猫分离株体外增殖理想的培养基；2个双歧杆菌大熊猫分离株均对红霉素、氯霉素等敏感，对青霉素等产生较高的耐药性；在较高温度下双歧杆菌大熊猫分离株能迅速地增殖，代谢能力大为提高，并与其他乳酸菌协同发酵，抑制致病菌的生长。双歧杆菌大熊猫分离株在体外生长良好，不是广谱的耐药菌株。

关键词：大熊猫双歧杆菌培养特性药敏试验

大熊猫作为动物的“活化石”，在地球上至少已存活了800万年，是我国特有的珍稀动物，被誉为“国宝”，然而由于其食物单调，数量稀少、繁殖率低下、疾病等原因使得大熊猫濒临灭绝，为了保护这一濒危动物，国家建立了很多自然保护区进行人工饲养［1］。饲养过程中肠道疾病是引起大熊猫死亡的主要原因，而肠道菌群失衡导致胃肠道功能紊乱又是引起大熊猫肠道疾病的主要原因，因此应用双歧杆菌制剂调节肠道菌群平衡，对防治大熊猫肠道疾病，保护这一濒危物种有着非常重要的意义［2］。目前，双歧杆菌制剂的研究主要集中在食品、人的保健、医疗、养殖等领域［3-7］，大熊猫双歧杆菌制剂的研究几乎是个空白，本试验对从大熊猫新鲜粪便中分离的双歧杆菌的培养特性、药敏试验及耐温驯化等进行研究，以期为双歧杆菌制剂应用于大熊猫肠道疾病的防治提供理论和试验基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种及培养基 两歧双歧杆菌和最小双歧杆菌，从人工饲养的健康大熊猫新鲜粪便中按照常规细菌分离方法分离得到。普通肉汤，改良肉汤，厌氧肉肝汤，牛乳培养基。

1.1.2主要仪器及试剂 高压蒸汽灭菌锅，上海博讯医疗器械厂生产；恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂生产；冰箱，海尔集团生产。焦性没食子酸，由衢州明锋化工有限公司生产，生产批号100316。氢氧化钠，由沧州隆昌化工有限公司生产，生产批号090817。标准抗菌药物纸片，由杭州天和微生物试剂有限公司生产。脱脂奶粉，由中国陕西和氏乳品有限公司生产。

1.2方法

1.2.1细菌培养 取分离的双歧杆菌接种于血琼脂平板、普通肉汤、厌氧肉肝汤和改良肉汤培养基中，放入恒温培养箱37℃培养24h取出，观察其在血琼脂平板上的菌落形态、进行革兰染色后显微观察细菌形态、观察其在三种不同培养基中的生长情况，并记录结果。

1.2.2药敏试验 药敏试验采取纸片琼脂扩散法。用灭菌棉签将两株双歧杆菌肉汤培养物均匀地涂抹于普通琼脂平板上，用消过毒的镊子将标准抗菌药物纸片贴压于普通平板上，整个操作在无菌间进行，然后放入恒温培养箱37℃培养24h后取出，测量并记录抑菌圈直径。

1.2.3耐温驯化 将两株双歧杆菌分别接种于牛乳培养基中，37℃培养，待凝乳后转接于另一只牛乳培养基中，38℃培养，如此逐渐递增至42℃。

2　结果

2.1细菌培养

显微镜观察分离的双歧杆菌为G+杆菌，呈分支状，单生、栅栏状、“V”字形或“Y”字形排列，菌落为小菌落，边缘整齐，隆起，灰白色，不透明，表面光滑。分离的双歧杆菌在改良肉汤培养基中生长旺盛，其中细菌含量远远高于另外两种培养基。

2.2药敏试验

本次药敏试验的结果为，两歧双歧杆菌对头孢唑啉、先锋塞肟、链霉素、红霉素、复方新诺明、氯霉素、万古霉素、四环素、卡那霉素及丁氨卡那霉素高敏，对庆大霉素中度敏感，对青霉素、氨苄青霉素、妥布霉素及诺氟沙星耐药；最小双歧杆菌对头孢唑啉、先锋塞肟、链霉素、红霉素、氯霉素、四环素、卡那霉素、丁氨卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素及诺氟沙星高敏，对万古霉素中度敏感，对青霉素、氨苄青霉素及复方新诺明耐药（表1和表2）。

2.3耐温驯化

两歧双歧杆菌在39℃之后凝乳时间加快，最小双歧杆菌凝乳时间平稳缩短，但两者在42℃时均缩短到3h～5h。

表1　双歧杆菌的药敏试验结果（mm）Table 1 The results of drug susceptibility tests of Bifidobacterium

3　讨论

双歧杆菌为专性厌氧菌，对营养要求苛刻，对氧气、温度等极为敏感，在体外培养比较困难，所以研究适合双歧杆菌生长的培养基非常重要［8］。本试验选用了普通肉汤、厌氧肉肝汤、改良肉汤培养基对双歧杆菌大熊猫分离株进行培养后发现，在改良肉汤培养基中其生长良好，细菌含量达到109CFU/mL以上，远远高于另外两种培养基，因此初步认为改良肉汤培养基是双歧杆菌大熊猫分离株体外增殖较为理想的培养基。由于针对双歧杆菌大熊猫分离株体外增殖条件的研究较少，因此适用于其生长的温度、pH、培养基的炭源、氮源、生长因子等条件的选择还需要作进一步的研究。

表2　双歧杆菌的药敏性Table 2 Results of drug susceptibility of Bifidobacterium

有文献报道，双歧杆菌对青霉素、万古霉素、红霉素等高敏，所有菌株均对氯霉素敏感［9］。但本试验结果显示，分离的两株双歧杆菌均对红霉素、氯霉素等敏感，对青霉素等产生耐药性，这与魏亚松等报道一致［10］，原因可能是人工饲养大熊猫添加饲喂抗生素引起体内菌群发生了变异，导致双歧杆菌大熊猫分离株在耐药性上与其他双歧杆菌表现不一致。

药敏试验结果显示，两个双歧杆菌大熊猫分离株对头孢唑啉、链霉素、卡那霉素、四环素及丁氨卡那霉素等高敏，因此临床应用双歧杆菌制剂时应避免与这些敏感的抗菌药配伍，以防止抗菌药物影响双歧杆菌制剂的活性和功效，如果双歧杆菌制剂需要与抗菌药物配伍使用时，可先使用抗菌药物控制感染后，再选用双歧杆菌制剂来调节菌群失调，以便更好发挥其疗效［11-12］。传统观念认为双歧杆菌作为肠道正常菌，具有抑制肠道病原微生物、提高免疫力、抗肿瘤等作用［4-7］，但近期国内外研究发现，肠道正常菌群产生耐药性后，可将其耐药性通过一定的方式传递给病原菌，从而加剧病原菌的耐药性，给肠道及非肠道感染性疾病的临床用药带来很大困扰［13-14］，因此要研制大熊猫双歧杆菌制剂，还需要从双歧杆菌大熊猫分离株耐药性产生的机理以及耐药性是否传递等方面作进一步的研究，以确保其应用的安全性。

双歧杆菌是动物肠道内的原籍菌，其最适生长温度与动物正常体温接近为37℃，但这个温度也是致病菌生长繁殖最适宜的温度［8］。本试验经过耐温驯化后，双歧杆菌大熊猫分离株可在较高温度42℃下迅速地增殖，代谢能力大为提高，且与其他乳酸菌协同发酵，有力地抑制致病菌的生长，这说明耐温驯化后双歧杆菌制剂可用于体温较高的患病大熊猫。

参考文献：

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Culture Characteristics and Drug Sensitivity Test of Two BifidobacteriumStrains in Panda

YANG Hui-ping1，MA Qing-yi2，GAO Rui1
（1.Yangling Vocational and Technical College，Yangling，Shaanxi，712100，China；
2.Shaanxi Research Center of Rare Wild Animal Rescue and Raise，Zhouzhi，Shaanxi，710402，China）

Abstract：Culture characteristics and drug sensitivity test of Bifidobacteriumare the base of studing Bifidobacteriummicroecologics.The two strains of Bifidobacteriumwere isolated from the fresh feces of panda.Through bacterial culture，drug sensitivity test and heat-resistant assay，the results showed that the best medium for panda bifidobacteria is improved broth，two strains of panda bifidobacteria are all sensitive to erythromycin and chloramphenicol ect，strong resistance to penicillin ect.At comparatively high temperature，panda bifidobacteria quickly multiplied and improved the metabolic capability，collaboratively fermented with other lactic acid bacteria，powerfully inhibited the growth of pathogenic bacteria.Panda bifidobacteria grew well in vitro.The isolated panda bifidobacteria are not extensive drug resistance strains.

Key words：panda；Bifidobacterium；culture characteristic；drug sensitivity test

作者简介：杨慧萍（1966-），女，副教授，硕士研究生，主要从事动物病理、药理和微生物等教学工作。

收稿日期：2014-12-10

中图分类号：S852.6

文献标识码：B

文章编号：1007-5038（2015）06-0171-03