贵州省H7亚型禽流感病毒感染的血清学和病原学分析

徐茂文，张　华，李　涛，张　霞，周碧君，文　明＊（.贵州大学动物疫病研究所，贵州贵阳55005；.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州贵阳550008）



贵州省H7亚型禽流感病毒感染的血清学和病原学分析

徐茂文1，张华2，李涛2，张霞2，周碧君1，文明1＊
（1.贵州大学动物疫病研究所，贵州贵阳550025；2.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州贵阳550008）

摘 要：为了解贵州省近几年H7亚型禽流感病毒感染情况，分别采集鸡血清3 031份、卵黄962份、咽-肛拭子1 607份、环境土壤拭子394份及野鸟粪便122份样本共计6 116份，采用血凝抑制试验（HI）和实时荧光定量RT-PCR方法进行H7亚型禽流感病毒特异性抗体和核酸检测。结果显示，在鸡血清和卵黄样本中，H7亚型禽流感表达特异性抗体的阳性率分别为1.2%（37/3 031）和2.3%（22/962）；在2 123份鸡咽-肛拭子、环境样本和野鸟粪便中，均未检测出H7亚型禽流感病毒核酸。这些结果表明贵州省家禽、野鸟和环境土壤中尚未发现H7亚型禽流感病毒感染。

关键词：H7亚型禽流感病毒；病原；调查

禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起家禽和野禽的一种高度接触性传染病，可呈现无症状感染或不同程度的呼吸道症状、产蛋率下降以及急性败血症等。根据禽流感病毒囊膜蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）抗原性差异，可分为H1～N16和N1～N9，不同HA和NA之间可形成100多种亚型AIV，但并不是所有亚型AIV都为高致病性和感染人［1-2］。

H7亚型禽流感是禽流感的一种亚型，属于一种高致病性禽流感病毒，可以感染人。近年来特别是2013年初，在上海、安徽等地发生了H7N9亚型禽流感病毒感染人病例，先后造成多人感染死亡。研究发现，这次出现的H7N9亚型禽流感病毒不是由经典的H7N9进化而来，而是不同亚型禽流感病毒进行基因重组所致，对禽类呈低致病性，而对人类却具有较强致病力［3-8］。与此同时，贵州省也发现了一例输入型人疑似H7N9亚型禽流感病毒感染死亡病例［9］，严重威胁着广大居民生命安全。为此，贵州大学动物疫病研究所在贵州省农业委员会和贵州省动物疫病预防控制中心等单位协助下，于2013年6月～12月采集了全省9个州（地、市）45个县（区、市）养禽场血样、蛋样和咽-肛拭子以及部分自然保护区野鸟粪便等，采用血凝抑制试验和RT-PCR技术进行特异性抗体与病毒核酸片段检测［10-11］，以期了解我省H7亚型禽流感感染状况，为H7亚型禽流感的预防与控制提供基础数据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1待检样本 采集自全省9个州（地、市）45个县（区、市）118个监测点，共计6 116份，其中鸡血液样本3 031份、鸡蛋样本962份、咽-肛拭子1 607份、环境土壤拭子394份（包括活禽交易市场和家禽屠宰点）和野鸟粪便122份。

1.1.2检测试剂 H7亚型禽流感血凝诊断抗原、H7亚型禽流感阳性血清和H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；RNA提取试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2方法

1.2.1H7亚型禽流感血清抗体检测 取采集的鸡血液样本，3 000r/min离心10min，收集血清，取H7亚型禽流感血凝诊断抗原与待检血清进行血凝抑制试验（HI），若HI效价大于或等于24时判为阳性；若HI效价等于或小于22时判为阴性；若HI效价等于22时判为可疑，需重复试验后再作判定。

1.2.2H7亚型禽流感卵黄抗体检测 取采集的鸡蛋样本，收集卵黄，与等量氯仿混合处理，8 000 r/min离心10min后取上清，取H7亚型禽流感血凝诊断抗原与待检卵黄处理液进行血凝抑制试验（HI），结果判定同血清样本检测。

1.2.3H7亚型禽流感病毒特异性核酸片段检测取采集的咽-肛、环境和野鸟粪便试子，用适量生理盐水处理，3 000r/min离心10min取上清，用RNA提取试剂盒提取病毒RNA样本，再用H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR进行检测。若阳性对照Ct≤30并出现特定扩增曲线，阴性对照无Ct且无特定扩增曲线，检测结果成立；当待检样品Ct ≤30并出现特定扩增曲线，判为阳性；待检样品Ct ≥37时判定为阴性；待检样品30＜Ct＜37并出现特定扩增曲线，需重做一次，两次结果一致即判为阳性。

2　结果

2.1H7亚型禽流感病毒血清抗体检测结果

采用血凝抑制试验（HI）对采集的鸡血清样本进行H7亚型禽流感病毒抗体检测（表1），在3 031份血清样本中，有37份为H7亚型禽流感病毒抗体阳性，阳性率为1.2%，其中种禽场为2.7%（8/ 297）、规模场为1.1%（29/2 585）和散养户为0（0/ 149）。

2.2H7亚型禽流感病毒卵黄抗体检测结果

采用血凝抑制试验（HI）对采集的鸡卵黄样本进行H7亚型禽流感病毒抗体检测（表2），在962份鸡血清样本中，有22份为H7亚型禽流感病毒抗体阳性，阳性率为2.3%，其中种禽场为5.0%（3/60）、商品场为2.3%（19/810）和散养户为0（0/92）。

2.3H7亚型禽流感病毒核酸检测结果

采用实时荧光定量RT-PCR技术对收集的2 123份咽-肛、环境和野鸟粪便试子进行H7亚型禽流感病毒核酸检测，结果发现所有样本均为H7禽流感病毒核酸阴性（表3）。

表1　家禽血清样本H7亚型禽流感病毒抗体检测Table 1 Detection of antibody to avian influenza virus type H7in chicken sera

表2　鸡卵黄样本H7亚型禽流感病毒抗体检测Table 2 Detection of antibody to avian influenza virus type H7in chicken yolk

表3　H7亚型禽流感病毒核酸检测Table 3 RT-PCR detection of nucleic acid of avian influenza virus type H7

3　讨论

3.1H7亚型禽流感血清抗体

动物机体感染病原体后常常产生特异性血清抗体，因此特异性血清抗体常作为监测病原体的一个重要指标。禽流感是一种重要的人畜共患病，过去分离的H7亚型禽流感病毒多为高致病性的，但目前发现一些H7亚型禽流感病毒毒株对家禽是低致病性的，而对人则显现高致病力［12］。因此，加强家禽H7亚型禽流感病毒监测是十分重要的。本次对我省9个地（州、市）118个监测点3 031份未免家禽血清样本检测发现，H7亚型禽流感血清抗体的阳性率为1.2%，其原因是：①少部分家禽可能存在H7亚型禽流感病毒感染；②在养禽场多次免疫的H5亚型禽流感疫苗中可能存在与H7亚型禽流感病毒的共同抗原；③H7亚型禽流感血凝诊断抗原可能存在一些交叉反应。

3.2H7亚型禽流感卵黄抗体

蛋鸡养殖是养禽业的重要组成部分。蛋鸡群养殖时间较肉鸡长，更容易受到病原体的侵染，特别是禽流感病毒。在开展家禽疫病血清学调查时，若在产蛋期实施血样采集，常常引起产蛋鸡群产生一定程度的应激反应，导致产蛋量下降，故一些蛋鸡养殖场（户）常不愿配合采血抽检。卵黄抗体是指免疫或感染家禽所产的蛋中存在的针对某种特定抗原的抗体；鸟类、爬行类和两栖类动物经免疫或感染后所产生的的免疫球蛋白IgG，能通过卵黄囊运输至蛋黄中［13］。由此可见，可通过检测卵黄抗体来作为监测产蛋鸡群免疫或感染状态的一个重要指标。本次对我省9个地（州、市）77个监测点962份未免家禽卵黄样本检测发现，H7亚型禽流感卵黄抗体的阳性率为2.3%，较血清样本的检出率稍高，其原因可能是蛋鸡养殖时间较长，H5或H9亚型禽流感疫苗免疫次数较多，而这些疫苗可能存在共同抗原所致。

3.3养殖环境H7亚型禽流感病毒

病原检测是确定动物感染发病或隐性携带病原体的重要手段。研究表明，2013年初发生在我国上海、安徽等地的H7N9亚型禽流感病毒是由于候鸟迁徙引起亚欧大陆迁徙的野鸟（携带病毒）在自然迁徙过程中和中国长三角地区的鸭群、鸡群携带的禽流感病毒进行基因重配而产生［2］。地球上主要有8条候鸟迁徙路线，其中经过我国主要有3条，即“东非西亚迁徒线”、“中亚迁徒线”和“东亚/澳大利亚迁徒线”［14-15］；在“中亚迁徒线”中，贵州省威宁草海是一个重要的候鸟迁徙地，而野生水禽是禽流感病毒重要的天然贮存者，在禽流感病毒的传播与变异中发挥重要作用。由此可见，迁徙到贵州省威宁草海及其周围地区的野鸟很有可能携带有H7亚型禽流感病毒，并传播和感染到养殖场或散养户饲养的家禽中。因此，本次调查不仅从规模养殖场、农村散养户、活禽交易市场和屠宰点等饲养或屠宰的鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑及其环境中采集棉拭子样本，而且从威宁草海、雷公山自然保护区和贵阳野生动物园等采集野鸟粪便样本。由于荧光定量PCR方法具有敏感性高、特异性强、省时简便、随时观察结果等特点，因此被选用于本次采收的棉拭子和粪便样本中H7亚型禽流感病毒核酸的检测，但均未检出H7亚型禽流感病毒核酸，说明贵州省野鸟及饲养家禽未受到H7亚型禽流感病毒的感染或污染。

参考文献：

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Analysis of Serology and Pathogen of Avian Influenza Subtype H7 Infection in Guizhou Province

XU Mao-wen1，ZHANG Hua2，LI Tao2，ZHANG Xia2，ZHOU Bi-jun1，WEN Ming1
（1.College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang，Guizhou，550025，China；
2.GuiZhou Center for Prevention and Control of Animal Disease，Guiyang，Guizhou，550001，China）

Abstract：To understand the infected situation of avian influenza virus（AIV）subtype H7in Guizhou Province，6 116samples in total were collected，including 3 031chicken sera and 962yolks，1 607pharyngealanal swab，394envirmental soil swabs and 122wild birds feces，for detection of the specific antibodies and nucleic acid of AIV subtype H7by hemagglutination inhibition test（HI）and quantitative RT-PCR respectively.The results showed that the positive rate of AIV subtype H7antibody were respectively 1.2%（37/ 3 031）and 2.3%（22/962）in the chicken sera and eggs，and the nucleic acid of AIV subtype H7was not detected in 2 123samples of pharyngeal-anal swabs，environmental swabs and wild birds feces.These results suggested that there are no infection of AIV subtype H7in the poultry，wild birds and environment in Guizhou province.

Key words：Avian influenza virus subtype H7；pathogen；investigation

作者简介：徐茂文（1988-），男，重庆人，硕士研究生，主要从事家禽疫病诊断与防治研究。＊通讯作者

基金项目：贵州省科技厅农业攻关项目（黔科合NZ字［2012］3007号）；贵阳市科技局农业科技项目（筑科合同［2012］102号）

收稿日期：2014-09-23

中图分类号：S852.659.5

文献标识码：B

文章编号：1007-5038（2015）06-0159-04