贵州省部分地区规模化猪场仔猪4种致猪腹泻病病毒感染调查

毛黎红，王开功＊，周碧君，文　明，程振涛，温贵兰，冯旭芳（1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳55005；.贵州省生猪质量安全工程技术研究中心，贵州开阳550001）



贵州省部分地区规模化猪场仔猪4种致猪腹泻病病毒感染调查

毛黎红1，2，王开功1，2＊，周碧君2，文明2，程振涛2，温贵兰2，冯旭芳2
（1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025；2.贵州省生猪质量安全工程技术研究中心，贵州开阳550001）

摘 要：为了解贵州省规模化猪场猪病毒性腹泻的流行情况，从5个地区9个规模化猪场采集的腹泻仔猪的粪便和病死猪的肠内容物及肠系膜淋巴结共66份，采用PCR或RT-PCR方法，分别进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（RV）和猪圆环病毒2型（PCV-2）的核酸检测。结果显示，PEDV、TGEV、RV和PCV-2检出率分别为72.72%、1.52%、12.12%和3.03%；PEDV/PCV-2、PEDV/RV、PEDV/TGEV混合感染率分别为3.03%、15.2%和1.52%，总混合感染率为19.70%，其中5个猪场为PEDV单独感染。结果表明，贵州省部分地区规模化猪场发生腹泻病的主要病原为PEDV，其次是TGEV、RV和PCR-2，且存在混合感染，为贵州省猪病毒性腹泻的防控提供一定的参考资料。

关键词：仔猪；猪流行性腹泻病毒；猪传染性胃肠炎病毒；猪轮状病毒；猪圆环病毒2型

猪腹泻是养猪生产中常见的一类疾病，是导致大批猪群死亡的重要原因之一，由于该病传播迅速，引起猪群腹泻、呕吐、脱水。即使猪群耐过存活，但该猪生长缓慢，致使饲料报酬降低，增加养殖成本［1］，对世界养猪业造成重大的经济损失。引起猪病毒性腹泻的病原有猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、猪轮状病毒（Rotarvirus，RV）、猪瘟病毒（Classical swin fever virus，CSFV）、猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）及猪圆环病毒2型（Porcine circovirus-2，PCV-2）等，其中以PEDV、TGEV、RV最为常见，同时与其他病毒混合感染［2］，3种病毒对各阶段猪群都易感，特别是对哺乳仔猪危害最大，致死率最高。英国于1971年在育肥猪群和架子猪群中首次发现PED，随后该病蔓延至欧洲以及亚洲国家，如日本、韩国等都受到高死亡率的威胁。1978年在比利时和英国首次鉴定。我国于1976年首次报道PED的发生，随后在26个省、市流行，在2010年10月-2012年初，南方地区广泛流行，直至目前仍没有消减的趋势。1945年Doyle和Hutchings在美国首次报道TGEV的存在，随后在欧洲、亚洲等国家广泛流行。我国于1956年在广东省首次报道，近年来该病的流行呈明显的上升趋势，目前对TGEV进行抗生素等常规药物治疗无效，主要采取疫苗注射预防。但由于现在不同地区毒株变异性较强，导致疫苗效果不佳。Woode和Bridge于1974年在英国首次报道了猪轮状病毒病，随后在美国、法国、澳大利亚等养猪国家报道大量检出RV。我国于1982年首次从腹泻病猪的粪便中首次分离到RV。1990年中国农业科学哈尔滨兽医研究所对我国19个省的猪场进行了血清学调查，结果显示猪群均为猪轮状病毒阳性，并证实RV在我国猪场已普遍存在，并呈上升趋势［3］。

本试验通过PCR和RT-PCR方法对贵州省2013年12月-2014年4月采集的66份具有明显腹泻症状的病料样本进行检测，旨在揭示仔猪病毒性腹泻在贵州省的流行情况以及主要感染病原，为基层兽医工作人员制定腹泻病防控方案提供参考，降低病毒性腹泻带来的危害。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病料 2013年12月-2014年4月，从贵州省5个地区（贵阳市、黔南州、黔东南州、遵义市和安顺市）9个规模化猪场采集腹泻仔猪的粪便、肠内容物、肠系膜淋巴结共计66份，于-80℃保存备用。PCV-2阳性病料于贵州省动物疫病研究室保存；TGEV-PEDV-RV三联活疫苗TGEV、PEDV和RV参考株为沈氏动保集团产品。

1.1.2主要试剂 RNAiso Plus总RNA提取试剂盒、dNTP、RNA酶抑制剂、反转录酶聚合酶为宝生物工程（大连）有限公司产品；DNA提取试剂盒、Taq DNA聚合酶为天根生化科技（北京）有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.2方法

参考文献1.2.1引物设计与合成［7-8］及根据GenBank中PEDV（登录号：AF353511）、TGEV（登录号：DQ811789）、RV（登录号：AF317123）和PCV-2（登录号：KJ187306）核酸序列，针对PEDV-COE、TGEV-S、RV-VP7和PCV-2-ORF2基因进行引物设计，送生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。

表1　引物信息Table 1 Primer information

1.2.2病料处理 猪粪便棉拭子样本用无菌无核酸水液做10倍稀释，病死仔猪肠系膜淋巴结研磨后用无菌PBS稀释，反复冻融2次～3次，8 000r/min离心5min；取上清液，4℃、12 000r/min，再次离心5 min，收集上清液，置-80℃保存。

1.2.3DNA提取及PCR扩增 用DNA提取试剂盒提取总DNA，PCR反应总体系50μL：10×PCR Buffer 5μL，dNTPs 1μL，PCV-2-F1/R1引物各为1.5μL（浓度为10 mmol/L），DNA 2μL，Taq酶1μL，ddH2O 38μL；PCV-2扩增条件为：94℃5min；94℃30s，56.5℃30s，72℃30s，共进行35个循环；最后72℃延伸10min。PCR反应结束后，经10g/L琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.2.4RNA提取及PCR扩增 按RNAiso Plus 总RNA提取试剂盒操作方法提取病料总RNA，以随机引物进行反转录，条件为：70℃水浴10min，冰浴5min后置42℃保温1h。再以引物PEDV-F1/ R1、TGEV-F1/R1和RV-F1/R1分别进行PCR扩增。PEDV、TGEV、RV的PCR反应总体系50μL：10×PCR buffer 5μL，dNTPs 1μL，上、下游引物各为1.5μL（浓度为10mmol/L），cDNA 2μL，Taq酶1μL，ddH2O 38μL；扩增条件为：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共进行35个循环；最后72℃10min。PCR反应结束后，经10g/L琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.2.5结果判定与分析 根据检测结果进行统计及分析。

2　结果

2.1腹泻病料中病原检测结果

应用PCR和RT-PCR方法对收集于贵州省5个地区的9个规模化猪场具有明显腹泻症状仔猪的66份病料样品进行PEDV、TGEV、RV和PCV-2核酸检测，按不同地区进行比较（表2），部分阳性病料PCR和RT-PCR检测电泳图（图1～图4）。PEDV的阳性检出率最高，其次是RV，TGEV和PCV-2为最低，分别为72.72%、12.12%、1.52%和3.03%。腹泻的发病日龄为4日龄～21日龄。疫苗免疫效果较差，免疫与未免疫猪场均有腹泻发生。

2.2规模猪场4种病毒混合感染检测结果

应用PCR和RT-PCR方法对贵州省5个地区的9个规模化猪场采集66份病料样品进行4种病毒混合感染检测，均存在PEDV、RV、TGEV、PCV-2的混合感染样品总计为13份，总混合感染率为19.70%。其中1个猪场存在PEDV与TGEV混合感染，阳性率为1.52%；2个猪场存在PEDV与PCV-2混合感染；阳性率为3.03%；2个猪场存在PEDV与RV混合感染，阳性率为15.2%，其余猪场均为单一感染（表3）。

表2　病原检测结果Table 2 Detection result of pathogen

图1　部分PEDV阳性PCR结果Fig.1 PCR amplification results of PEDV samples

图2　部分RV阳性PCR结果Fig.2 PCR amplification results of RV samples

图3　部分TGEV阳性PCR结果Fig.3 PCR amplification results of TGEV samples

图4　部分PCV-2阳性PCR结果Fig.4 PCR amplification results of PCV-2samples

表3　4种病毒混合感染结果Table 3 Result of mixed infection with four kinds of viruses

3　讨论

本研究对贵州省部分地区临床表现的9个规模化养殖场进行了病原学的流行病学调查，结果发现2013年12月-2014年4月贵州省发生猪腹泻的规模化养殖场PEDV的检出率为72.7%，TGEV检出率为0.02%，RV检出率为12.12%；PCV-2检出率为0.02%。说明贵州省仔猪病毒性腹泻主要病原为PEDV，其次是RV。张坤等［4］对河南、湖北、湖南、江西、广西等省的猪场调查也显示，PEDV的阳性率仍然为最高，而TGEV的阳性率最低；肖博仁［5］对湖南不同地区发生腹泻的养猪场进行PEDV流行病学调查，其阳性率为65%。秦谷雨等［6］对安徽省37个规模化养猪场采集腹泻仔猪粪便和肠断进行检测，PEDV阳性率为59.1%、TGEV阳性率为5.4%、RV阳性率为

2.7%。孙振钊等［7］从219份样品检测显示PEDV的阳性率为17.35%，PRV为7.76%和TGEV为0。由此可见，全国引起仔猪腹泻的主要病原为PEDV。

根据对贵州省5个地区9个规模养殖场进行混合感染调查发现，1个猪场存在PEDV与TGEV混合感染，阳性率为0.02%；1个猪场存在PEDV与PCV-2混合感染；阳性率为0.02%；2个猪场存在PEDV与RV混合感染，阳性率为15.2%。于晓龙［8］对黑龙江省发病猪场的113份样品和52份样品进行病原检测，结果显示TGEV检出率11.9%，与PEDV混合感染占29.2%。TGEV与RDV混合感染率28.8%。由此可见，在全国各地PEDV普遍存在，一旦感染，传播迅速，对哺乳仔猪的致死率极高。杜季梅［9］采集了河南省58个不同规模的猪场181份发病仔猪的病料，进行了PEDV、TGEV、PoRV、CSFV、PRV病原检测。PEDV阳性检出率为71.27%，与TGEV、PoRV、CSFV和PRV的混合感染率分别为2.76%、2.21%、56. 91%和17.13%，与CSFV、PRV的三重混合感染阳性检出率为17.10%，而与TGEV、PoRV的三重混合感染率仅为0.55%。王元等［10］对新疆部分引起仔猪腹泻259份临床病料进行病原核酸进行检测，检出PEDV阳性163份，Kubovirus阳性97份，PEDV、Kubovirus混合感染96份。表明仔猪腹泻发生不止单一病原感染，常常存在混合感染情况。本试验通过对2013年12月-2014年4月病毒性腹泻病原进行调查，引起贵州省猪病毒性腹泻流行的病毒以PEDV为主。

［1］ Song D，Park B，Porcine epidemic diarrhoea virus：a comprehensive review of molecular epidemiology，diagnosis，and vaccines［J］.Virus Genes，2012，44（2）：167-75.

［2］ 田小燕，孙 华，邓雨修，等.3种致猪腹泻病毒的多重RT-PCR检测［J］.动物医学进展，2009，30（9）：54-57.

［3］ 陈淑红，王新生.猪轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究［J］.中国预防兽医学报，2004，26（1）：42-44.

［4］ 张 坤，何启盖.猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用［J］.畜牧兽医学报，2010，41（8）：1001-1005.

［5］ 肖博仁.湖南地区猪流行性复学病毒的分子流行病学和血清流行病学调查［D］.湖南长沙：湖南农业大学，2012.

［6］ 秦谷雨，杨 勇，李 郁，等.安徽省仔猪腹泻5种病毒感染情况的调查研究［J］.动物医学进展，2012，33（12）：59-63.

［7］ 孙振钊，赵伟男，王靖飞，等.猪腹泻病例中PEDV、TGEV及PRV的感染调查［J］.动物医学进展，2014，35（5）：132-135.

［8］ 于晓龙.猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒混合感染的PCR检测［J］.中国农学通报，2006，22（8）：33-35.

［9］ 杜季梅.仔猪病毒性腹泻流行病学调查及卵黄抗体在PEDV防治中的应用［D］.河南郑州：河南农业大学，2013.

［10］ 王 元，杜久斌，范红燕，等.新疆部分规模化猪场猪病毒性腹泻流行病学调查与防控［J］.猪业科学，2013（8）：89-90.

Investigation on Infections with Four Kinds of Viruses Causing Porcine Diarrhea in Large-scale Pig Farms in Parts of Guizhou Province

MAO Li-hong1，2，WANG Kai-gong1，2，ZHOU Bi-jun2，WEN Ming2，CHENG Zhen-tao2，WEN Gui-lan2，FENG Xu-fang2
（1.College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang，Guizhou，550025，China；2.The Pig Quality and Safety Pigs Engineering Technology Research Center，Guiyang，Guizhou，550000，China）

Abstract：To understand porcine viral diarrhea prevalence in parts of Guizhou province，feces of piglets with diarrhea and intestinal contents and mesenteric lymph nodes of dead pigs were collected（66samples in total）from nine large-scale pig farms in five regions.By PCR or RT-PCR，those samples were detected for porcine epidemic diarrhea virus（PEDV），porcine transmissible gastroenteritis virus（TGEV），porcine rotavirus（RV）and porcine circovirus type 2（PCV-2），respectively.The results showed that the detection rate of PEDV，TGEV，RV and PCV-2were 72.72%，1.52%，12.12%and 1.52%；the mixed infection rate of PEDV/PCV-2，PEDV/RV，PEDV/ TGEV were 3.03%，15.2%and 1.52%；the total mixed infection rate was 19.70%，and there were five farms with the single infection of PEDV.The results show that，diarrheas happened in large scaled pig farms in partial areas of Guizhou province mainly resulted from PEDV，and TGEV，RV and PCV-2are also major pathogens.Mixed infection can be found in those areas.Those results provide references for prevention against viral diarrhea in Guizhou province.

Key words：piglet；Porcine epidemic diarrhea virus；Transmissible gastroenteritis virus；Rotarvirus；Porcine circovirus-2

作者简介：毛黎红（1989-），女，贵州石阡人，硕士研究生，主要从事兽医微生物学与免疫学研究。＊

通讯作者

基金项目：贵州省生猪质量安全工程技术研究中心建设项目（黔科合农C字［2011］4022号）；贵州省重大科技专项（黔科合重大专项字［2011］6021-4号）；贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室培育（黔科合计Z字［2011］4008号）；贵州省农业委员会科技计划项（2014-01号）

收稿日期：2014-07-28

中图分类号：S858.28

文献标识码：B

文章编号：1007-5038（2015）05-0121-04