结核分支杆菌Rv2031c慢病毒载体的构建及其对RAW264.7细胞凋亡的影响

史梦婷，孟露萍，包海洋，付　强，史慧君，王慧勤，张　辉，任　艳，乔　军，陈创夫＊（.石河子大学生命科学学院，新疆石河子8000；.石河子大学动物科技学院，新疆石河子8000；.石河子大学医学院，新疆石河子8000）



结核分支杆菌Rv2031c慢病毒载体的构建及其对RAW264.7细胞凋亡的影响

史梦婷1△，孟露萍2△，包海洋2△，付强2，史慧君2，王慧勤1，张辉2，任艳3，乔军2，陈创夫2＊
（1.石河子大学生命科学学院，新疆石河子832000；2.石河子大学动物科技学院，新疆石河子832000；3.石河子大学医学院，新疆石河子832000）

摘 要：研究结核分支杆菌Rv2031c基因对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分支杆菌Rv2031c的序列设计引物，以结核分支杆菌国际标准株H37Rv株灭活的菌液上清液为模版，扩增Rv2031c基因；克隆至慢病毒表达载体plex-EGFP中，经酶切和测序鉴定后，获得plex-Rv2031c-EGFP重组慢病毒载体；将重组慢病毒质粒分别与辅助质粒共转染至293T细胞中，转染48h后收集慢病毒，并侵染RAW264.7细胞；侵染48h时收集细胞，用流式细胞术检测各试验组巨噬细胞的凋亡率；提取细胞总RNA并反转录成cDNA，PCR检测Rv2031c基因在细胞中的表达情况；同时，使用细胞裂解液提取细胞总蛋白，Western blot检测Rv2031c蛋白表达水平。结果表明，成功构建了Rv2031c的慢病毒表达载体plex-Rv2031c-EGFP；构建了过表达Rv2031c的慢病毒Rv2031c-lv；感染Rv2031c-lv的RAW264.7细胞的凋亡率为41.8%，而对照组EGFP-lv感染的RAW264.7细胞其凋亡率为30.0%；PCR结果表明Rv2031c在Rv2031c-lv侵染的RAW264.7细胞中高表达；Western blot结果显示Rv2031c蛋白在Rv2031c-lv侵染的RAW264.7细胞中高表达。该研究成功构建了结核分支杆菌Rv2031c的慢病毒表达载体并验证了其对RAW264.7细胞凋亡的影响，为结核分支杆菌在机体内潜伏期感染的药物研究奠定了基础。

关键词：Rv2031c；慢病毒；RAW264.7细胞；细胞凋亡

结核病（Mycobacterium，TB）是由结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一种人兽共患慢性传染病，是继艾滋病之后的最大感染性疾病之一［1］。结核病对家畜以及人的危害都很严重［2］。在我国呈现感染基数大，传染源多，而发现率低至26%等特点，严重危害着人和动物的健康［3］。作为人兽共患和慢性消耗性传染病的结核病拥有广泛的宿主，且可以交互传染，很难彻底消灭［4］。据文献报道，全世界感染结核分支杆菌的人数大约占到了30%，而真正发病的人数仅仅为其中的1/9，其他都处于结核病的休眠期。且处于休眠期的结核分支杆菌对现已广泛使用的结核疫苗不敏感。这种传染性极强的疾病之所以发现率低，是由于结核分支杆菌在进入寄主后会在肺泡巨噬细胞中繁殖，而寄主的局部免疫等反应会抑制这一过程的发生，从而使结核分支杆菌进入潜伏感染期，在这一阶段中患者无任何病症［5］；处于潜伏感染期即休眠期的结核分支杆菌生存活力低，导致抗结核药物对其效果差。因此，处于潜伏期的结核病患者成为了结核病传播的重要隐患［6］。潜伏期的存在也使结核病的复发困扰着已经治愈的患者。研究发现，处于潜伏期的结核分支杆菌能编码与休眠有关的蛋白48个［5］，而其中表达量较高的以及免疫原性较突出的一种蛋白就是Rv2031c。Rv2031c具有较高的免疫原性，而且在结核分支杆菌的潜伏期表达量较高［7］。因此，本研究中以Rv2031c蛋白为研究对象，研究慢病毒介

导Rv2031c基因过表达后对小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的影响，为探究结核分支杆菌的潜伏期提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1载体 慢病毒表达载体plex-EGFP及其包装质粒（pSPAX和pMD2.G）均由刘明军教授（新疆畜牧科学院生物技术研究中心）惠赠。

1.1.2主要试剂 Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基公司；鼠抗Rv2031c抗体（货号ab64786）购自美国Abcam公司；鼠抗β-actin抗体（货号BS6007M）和山羊抗鼠IgG（H+L）-HRP二抗（货号BS50350）均购自南京Bioworld公司；高纯度质粒大提试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；增强型HRP-DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液和PMSF购自江苏碧云天生物科技公司；pMD19-T载体和限制性内切酶（SpeⅠ和XhoⅠ）购自宝生物工程（大连）有限公司；细胞RNA提取试剂盒、cDNA第一条链合成试剂盒、无内毒素大提质粒试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；聚凝胺购自美国Sigma公司；HET磷酸钙转染试剂盒购自深圳百恩维生物科技有限公司；其他分子生物学试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.1.3细胞和菌株 小鼠巨噬细胞（RAW264.7）以及人胚肾细胞（293T）购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；所有细胞都使用含100mL/L胎牛血清（Gibco）的DMEM高糖培养基（Gibco）进行培养；结核分支杆菌国际标准株H37Rv为石河子大学动物疫病防控兵团重点实验室保存。

1.2方法

1.2.1引物设计 根据GenBank数据库中结核分支杆菌国际标准株H37Rv的Rv2031c基因序列（登录号AL123456），使用Primer premier 5.0软件设计引物扩增Rv2031c序列（表1），引物由北京六合华大基因有限公司合成。带下划线部分为酶切位点。

表1　扩增Rv2031c基因的引物Table 1 Primers for amplifying Rv2031cgene

1.2.2Rv2031c基因的克隆 以结核分支杆菌国际标准株H37Rv cDNA为模版，用Rv2031c-F和 Rv2031c-R引物扩增含酶切位点Rv2031c序列。PCR反应体系为：Taq PCR Master mix 10.0μL，上、下游引物各0.6μL，模板1.0μL，补ddH2O至20.0μL。PCR反应条件为：95℃5min；94℃40s，67℃40s，72℃50s，35个循环；72℃7min。用15g/L琼脂糖凝胶检测PCR产物；并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因，并与pMD19-T载体连接，转化DH5α，经菌液PCR、酶切以及测序鉴定后，获得重组载体Rv2031c-pMD19-T。

1.2.3慢病毒表达载体plex-Rv2031c-EGFP的构建使用SpeⅠ和XhoⅠ双酶酶切plex-EGFP和Rv2031cpMD19-T，酶切体系为：10×H buffer 2.0μL，SpeⅠ和XhoⅠ各1.0μL，plex-EGFP/Rv2031c-pMD19-T 10.0 μL，补ddH2O至20.0μL；置于37℃孵育4h。使用凝胶回收试剂盒回收双酶切产物，并将双酶切目标产物使用T4DNA连接酶连接；连接体系为：plex-EGFP 1.5μL，Rv2031c回收产物4.5μL，T4DNA连接酶1.0μL，补ddH2O至10.0μL；置于16℃过夜连接；并转化至感受态细胞DH5α中，经PCR、酶切以及测序鉴定后，获得重组载体plex-Rv2031c-EGFP。

1.2.4慢病毒包装 使用无内毒素大提质粒试剂盒并按照其说明书提取plex-Rv2031c-EGFP、plex-EGFP、pSPAX和pMD2.G质粒；接种1×106个293T细胞至10cm细胞培养板中，37℃、体积分数为5% CO2培养至细胞达到80%汇合度；按照HET磷酸钙转染试剂盒说明书将12.0μg plex-Rv2031c-EGFP/ plex-EGFP及慢病毒包装质粒（9μg pSPAX和4μg pMD2.G）共转染至293T细胞中；转染后12h时，更换新鲜培养基；转染后48h时，收集上清并使用0.45 μm Millipore滤器过滤收集慢病毒。

1.2.5慢病毒侵染RAW264.7细胞 使用2.5g/L胰酶消化RAW264.7细胞，并按5×105个/孔的浓度将RAW264.7细胞接种到六孔板中，加入慢病毒悬液，并添加8.0μg/mL聚凝胺作为促感染剂；混匀后置于37℃、体积分数为5%的CO2培养条件下继续培养12h后，更换新鲜培养基。

1.2.6流式细胞仪检测凋亡水平 用2.5g/L胰酶消化慢病毒侵染后48h时的RAW264.7细胞，2 000 r/min离心5min收集细胞；用0.1mol/L PBS洗涤细胞2次；加入500μL Binding buffer重悬细胞；加入5μL Annexin V-APC混匀后；再加入5μL 7-AAD染液，混匀；室温避光反应15min；用流式细胞仪FL4通道检测Annexin V-APC的红色荧光，并用FL3通道检测7-AAD的红色荧光。

1.2.7PCR检测Rv2031c基因 收集慢病毒

Rv2031c-lv和EGFP-lv分别侵染后48 h时的RAW264.7细胞，使用细胞总RNA提取试剂盒提取总RNA，并反转录成cDNA；以cDNA为模板，使用Rv2031c-F和Rv2031c-R引物扩增Rv2031c基因，PCR体系及条件同1.2.2。

1.2.8Western blot检测Rv2031c表达水平 收集慢病毒侵染后48h时的RAW264.7细胞；按照RIPA裂解细胞试剂盒说明书，用RIPA裂解液（含1mmol/L PMSF）裂解细胞，提取细胞总蛋白；并用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白的浓度；加入等质量的总蛋白进行SDS-PAGE电泳；Western blot方法参考《分子克隆实验指南》；鼠抗Rv2031c一抗稀释度为1∶2 500，鼠抗β-actin一抗稀释度为1∶5 000，山羊抗鼠IgG（H+L）-HRP二抗稀释度为1∶10 000；使用DAB显色试剂盒进行免疫印迹显色。

1.2.9统计学分析 使用SPSS 17.0软件对试验数据进行进行单因素方差统计分析（ANOVA）。数据为平均数±标准差（-x±SD）。＊P＜0.05为差异显著；＊＊P＜0.01为差异极显著。

2　结果

2.1Rv2031c基因克隆

以结核分支杆菌国际标准株H37Rv cDNA为模板，使用Rv2031c-F和Rv2031c-R作为上、下游引物，PCR扩增Rv2031c基因，用15g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物（图1），Rv2031c基因的PCR产物大小约为435bp，和预期的条带大小相符。

图1　Rv2031c的PCR结果Fig.1 PCR results of Rv2031c

2.2双酶切鉴定重组慢病毒表达载体plex-Rv2031c-EGFP

使用SpeⅠ和XhoⅠ双酶酶切重组慢病毒表达载体plex-Rv2031c-EGFP，并使用琼脂糖凝胶电泳检测双酶酶切产物（图2），出现plex-EGFP质粒条带（11 400 bp）和Rv2031c基因条带（435bp），与预期结果相符。

2.3慢病毒包装

分别将慢病毒载体plex-Rv2031c-EGFP和plex-EGFP与包装辅助质粒共转染至293T细胞中。转染后48h时，使用荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况。绿色荧光蛋白高表达，表明Rv2031c-lv和EGFP-lv成功包装（图3）。

图2　Plex-Rv2031c-EGFP酶切结果Fig.2 Enzyme digestion results of plex-Rv2031c-EGFP

图3　慢病毒包装Fig.3 Lentivirus generation

2.4慢病毒侵染RAW264.7细胞

Rv2031c-lv和EGFP-lv慢病毒分别感染RAW264.7细胞48h后，荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白表达效果。慢病毒EGFP-lv和Rv2031c-lv感染RAW264.7细胞后，绿色荧光蛋白高效表达，表明慢病毒EGFP-lv和Rv2031c-lv能感染RAW264.7细胞，并且侵染效果较好（图4）。

2.5PCR检测Rv2031c基因

分别取EGFP-lv和Rv2031c-lv侵染的RAW 264.7细胞的cDNA作为模板，使用Rv2031c-F和Rv2031c-R引物进行PCR。Rv2031c-lv侵染后，PCR可以检测到Rv2031c基因，而EGFP-lv侵染不能检测到该基因，其结果与预期结果一致（图5）。

2.6Western blot检测Rv2031c蛋白表达水平

慢病毒感染RAW264.7细胞后48h时，提取细胞总蛋白；Western blot技术检测相同质量总蛋白中Rv2031c蛋白含量。Rv2031c-lv感染的RAW264.7细胞后Rv2031c蛋白表达量较高；而EGFP-lv感染RAW264.7细胞后，未见Rv2031c蛋白表达，结果与预期结果一致（图6）。

图4　慢病毒侵染RAW264.7细胞Fig.4 RAW264.7infected with lentivirus

图5　PCR检测Rv2031c基因Fig.5 Detection of Rv2031cgene by PCR

图6　Western blot检测Rv2031c蛋白表达Fig.6 Detection of Rv2031cprotein expression by Western bloting

2.7细胞凋亡率的检测

慢病毒感染RAW264.7细胞后48h时，收集细胞，使用凋亡检测试剂盒进行染色处理，并使用流式细胞仪检测RAW264.7细胞凋亡水平。Rv2031c-lv感染RAW264.7细胞后，细胞凋亡率为41.8%；而EGFP-lv感染的RAW264.7细胞后，细胞凋亡率为30.0%。结果表明，Rv2031c-lv感染增加了RAW 264.7的凋亡率，同时也证明了Rv2031c基因表达促进RAW264.7的凋亡（图7和图8）。

3　讨论

Rv2031c在结核病的休眠期呈现了高表达的状况，体现出了Rv2031c在结核病的休眠期有关键的作用［8］。为了降低结核病传染源的数量，揭开结核病潜伏期的致病机制，所以本试验以潜伏期高表达高免疫原性的Rv2031c蛋白为研究对象，构建重组慢病毒表达载体，并包装慢病毒，侵染小鼠巨噬细胞RAW 264.7，从而利用慢病毒介导的方式使Rv2031c基因在RAW264.7细胞中高水平表达，从而为研究Rv2031c蛋白在结核分支杆菌潜伏期中的重要作用提供材料。虽然Rv2031c蛋白在潜伏期高表达，但其在结核分支杆菌感染过程中的具体作用尚未可知［9］。

图7　流式细胞仪检测RAW264.7细胞的凋亡率Fig.7 Detection of RAW264.7cell apoptosis rates by flow cytometry

图8　RAW264.7细胞凋亡率的数据分析Fig.8 Data analysis of RAW264.7cell apoptosis rates

研究表明，Rv2031c实际上是结核分支杆菌hspX基因的重要组成部分，而Hsp16.3就是由hspX基因编码的一类与结核病休眠期密切相关的重要的膜抗原［10］。Hsp16.3拥有鼠和人的T细胞抗原表位，能产生特异免疫反应，而且其肽段具有活化部分CD4T细胞和识别并活化CD8T细胞，分泌γ干扰素以及α干扰素的功能，之后被MTB感染的巨噬细胞被粒细胞溶解素和表位穿孔素溶解，最终有效杀灭结核分支杆菌［11］。本试验涉及的Rv2031c与Hsp16.3有直接关系，且由Rv2031c构成的hspX基因能编码Hsp 16.3［12］，而Hsp16.3能通过一系列干扰素的产生强有力地清除处于休眠期体内的结核分支杆菌［13-14］，从而能有效的减少感染结核病并处于休眠期的患者数量，并为结核病休眠期的鉴定及治疗奠定基础。

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Constraction of Lentiviral Vector of Mycobacterium tuberculosis Rv2031c and Its Effects on Apoptosis of RAW264.7 Cells

SHI Meng-ting1，MENG Lu-ping2，BAO Hai-yang2，FU Qiang2，SHI Hui-jun2，WANG Hui-qin1，ZHANG Hui2，REN Yan3，QIAO Jun2，CHEN Chuang-fu2
（1.College of Life Science，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang，832000，China；2.College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang，832000，China；3.College of Medicine，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang，832000，China）

Abstract：To investigate the effects of Mycobacterium tuberculosis Rv2031cgene on apoptosis of RAW264.7macrophages，primers for Rv2031cwere designed based on GenBank database.Rv2031cgene was amplified fromMycobacterium tuberculosis international reference strain H37Rv and cloned into lentivirus expressing vectoe plex-EGFP. After identifying with enzyme digestion and sequencing，the recombinated lentivirus expressing vector plex-Rv2031c-EGFP was constructed successfully.After transfection lentivirus expressing vector with the helper plasmids into 293Tcells，lentiviral particles were generated.The rate of apoptosis was determined in RAW264.7cells using flow cytometry at 48hpost-infection with lentivirus.Total RNA was extracted from lentivirus infected RAW 264.7and reversely transcribed into cDNA，mRNA levels of Rv2031cwere detected using PCR.Moreover，cells were harvested and subjected to extract total protein，protein levels of Rv2031cwere determined by Western blot.Lentivirus expressing vector plex-Rv2031c-EGFP and Rv2031c-overexpressing lentivirus Rv2031c-lv were constructed successfully.Rate of apoptosis in Rv2031c-lv infected cells was 41.8%，whereas it was 30.0%in negative control group，suggesting Rv2031coverexpression significantly increased RAW264.7cells apoptosis.The results of PCR and Western blot indicated that Rv2031cwas high expressed in Rv2031c-lv infected cells compared to the negative control.In this study，we successfully constructed Rv2031cexpressing lentivirus and analyzed its function on RAW264.7apoptosis，which will provide a stable foundation on selecting drugs against Mycobacterium tuberculosisincubation period.

Key words：Rv2031c；lentiviruses；RAW264.7cell；apoptosis

作者简介：史梦婷（1989-），女，新疆石河子人，硕士研究生，主要从事动物功能基因组与分子免疫学研究。孟露萍（1989-），女，河北石家庄人，硕士研究生，主要从事分子病毒学研究工作；包海洋（1989-），男（满族），河北承德人，硕士研究生，主要从事结核分支杆菌蛋白质组学研究。△同等贡献作者。＊通讯作者

基金项目：国际科技合作项目（2013DFR30970）；国家自然科学 （U1303283）

收稿日期：2014-10-17

中图分类号：S852.618

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）05-0001-05