临床分离表皮葡萄球菌附属基因调节因子agr基因多态性分析

杨永长，肖代雯，陈　亮，刘　华，喻　华，黄文芳

(四川省医学科学院·四川省人民医院 检验科,四川 成都610072)

临床分离表皮葡萄球菌附属基因调节因子agr基因多态性分析

杨永长，肖代雯，陈亮，刘华，喻华，黄文芳*

(四川省医学科学院·四川省人民医院 检验科,四川 成都610072)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0587)

表皮葡萄球菌(S.epidermidis)广泛分布于人体皮肤和黏膜表面，过去一直认为它是人体的正常菌群。近年来，随着各种插管，透析技术，医用材料等在临床上的应用日益增多，S.epidermidis成为引起院内感染的重要病原体。在美国，据估计每年用于治疗S.epidermidis引起的血流感染的费用大约需要20亿美元[1]。S.epidermidis感染已引起医学界的广泛关注。

生物被膜形成是S.epidermidis的主要致病因素，生物被膜的形成受多种基因的调节，其中附属基因调节因子agr在生物被膜形成过程中发挥重要调控作用[2]。Agr系统包括4种共转录分子agrA,agrC,agrD,agrB和效应分子RNAIII，通过调节生物被膜相关因子抑制生物被膜的形成。研究显示，agr基因在S.epidermidis中呈多态性，有三种agr型别[3]。Li等[4]研究表明，agr基因多态性与S.epidermidis的致病性明显相关，且临床分离S.epidermidis中绝大部分属于agr Ⅰ型。最近Mertens等[5]研究显示，从血培养和植入材料分离的S.epidermidis以agr Ⅱ型和agr Ⅲ型为主，而在多重耐药分离株中，以agr Ⅰ型和agr Ⅲ型为主。以上研究结果提示，临床分离S.epidermidis的agr型别存在差异。本研究通过多重PCR检测临床分离S.epidermidis的agr型别，进一步了解我国临床分离S.epidermidis的agr基因多态性，探讨甲氧西林耐药和标本来源与agr型别的关系。

1材料与方法

1.1　菌株

84株表皮葡萄球菌来自2012年3月至2013年3月门诊及住院患者分离的无重复菌株，所有菌株采用全自动微生物鉴定系统鉴定，其中血液分离56株，痰液分离16株，中段尿液分离5株，伤口分泌物分离7株。

1.2　仪器和试剂

PCR 反应试剂、100bp DNA Marker 购自北京康为世纪公司，PCR 扩增仪购自美国Bio-Rad 公司，高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，电泳仪购自美国Savant公司，凝胶成像系统购自美国Bio-Rad 公司。esp,mecA和agr分型的引物由上海英俊公司合成。

1.3　细菌DNA提取

复苏低温保存的表皮葡萄球菌，接种至血平板，37 ℃ 5%CO2培养24 h，收集细菌，10 000 rpm离心5 min，沉淀加40 μl DNA提取液，加热100℃ 10 min后，10 000 rpm离心5 min，上清液即为表皮葡萄球菌DNA。

1.4　PCR扩增esp基因

esp基因的引物序列为esp F:5'-CCAGGGTAACCAGTAACAGT-3',esp R:5'-GAG CTAAGGGTAATCCAAGA-3',PCR产物长度为244 bp;反应体系：2×Taq PCR Master Mixture 10 μl，10 μM上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O 6 μl。反应条件：93℃预变性2 min，93℃变性30 s,42℃退火30 s,72℃延伸30 s，进行30个循环，最后72℃延伸2 mim，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.5　PCR扩增mecA基因

mecA基因的引物序列为mecAF:5'-GGGATCATAGCGTCATTATTC-3'，mecAR:5'-AACGATTG TGA CACGATAGCC-3'，PCR产物长度为527 bp。反应体系：2×Taq PCR Master Mixture 10 μl，10 μM上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O 6 μl。反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，44℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行30个循环；最后72℃延伸3 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后Bio-Rad凝胶成像仪检测。

1.6　多重PCR扩增agr等位基因

参考文献根据[6]合成引物，agr分型的引物序列及PCR产物长度见表1，反应体系：2×Taq PCR Master Mixture 10 μl，10 μM上下游引物各0.1 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O 7.4 μl。反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，进行25个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后Bio-Rad凝胶成像仪检测。

表1　表皮葡萄球菌agr分型引物序列及PCR产物长度

2结果

2.1　PCR扩增esp基因鉴定表皮葡萄球菌

PCR扩增结果显示，临床分离的84株表皮葡萄球菌均可扩增出244 bp的esp基因片段，证实这些菌株都是表皮葡萄球菌。

2.2　PCR扩增mecA基因区分MSSE和MRSE

临床分离的84株表皮葡萄球菌中，mecA扩增阳性64株，mecA阴性20株，其中血液，痰液，尿液和伤口分泌物分离mecA阳性菌株分别为43例，11例，5例和5例，提示不同来源分离的表皮葡萄球菌均以MRSE为主。

2.3　多重PCR扩增agr等位基因分析表皮葡萄球菌agr基因多态性

多重PCR凝胶电泳结果如图1所示，临床分离的84株表皮葡萄球菌中，可进行agr分型的表皮葡萄球菌为64株，agr未分型为20株。在MSSE和MRSE中agr基因亚型的分布如表2所示,不同来源分离的表皮葡萄球菌的agr基因亚型分布如表3所示，结果表明，MRSE中以agr Ⅰ型和agrⅢ型为主，血液来源表皮葡萄球菌以agr Ⅰ型，agr未分型和agr Ⅲ型较普遍，非血液来源表皮葡萄球菌以agr Ⅰ型为主。

Lane 1,2:agr Ⅰ型表皮葡萄球菌;Lane 3:100 bp DNA Ladder;Lane 4:agr Ⅰ型表皮葡萄球菌;Lane 5:agr Ⅱ型表皮葡萄球菌;Lane 6:agr Ⅲ型表皮葡萄球菌

图1　多重PCR扩增表皮葡萄球菌agr等位基因电泳图

表3　不同来源分离表皮葡萄球菌agr基因亚型分布

3讨论

近年来，随着留置静脉导管等侵袭性操作的增多，表皮葡萄球菌已成为最重要的院内感染病原菌。表皮葡萄球菌的致病性主要与形成生物被膜的能力密切相关。生物被膜可逃逸机体免疫系统的攻击，降低其对抗生素的敏感性，引起慢性反复感染，延长住院时间，增加治疗费用[7-8]。随着多重耐药菌株的出现，这种情况变得越来越严重。因此，深入了解生物被膜的调控变得特别重要。

葡萄球菌agr是一种重要的生物被膜调控系统。研究显示，表皮葡萄球菌agr基因具有多态性，Dufour等[3]通过序列分析发现表皮葡萄球菌有三种agr型别，2004年Li等[4]通过PCR-RFLP和DNA测序技术研究发现，在临床分离的表皮葡萄球菌中，以agrⅠ型为主，而在正常皮肤表面分离的表皮葡萄球菌以agrⅡ型为主，同时存在大约15%的表皮葡萄球菌agr自然突变。Hellmark等[9]发现人工关节感染表皮葡萄球菌中，以agrⅠ型和agrⅢ型为主。Mertens等[5]研究显示血培养和植入材料分离的表皮葡萄球菌以agrⅡ型和agrⅢ型为主，但在多重耐药菌株中以agrⅠ型和agrⅢ型为主。

本研究中，我们通过PCR扩增mecA基因区分甲氧西林敏感和耐药表皮葡萄球菌，同时通过多重PCR扩增表皮葡萄球菌agr等位基因，分析agr基因多态性。结果显示，MSSE菌株约占1/4，11株agr未分型。MRSE菌株约占3/4，以agrⅠ型和agrⅢ型为主，同时伴有部分agr未分型菌株。从标本来源看，血液来源的标本以agrⅠ型，agr未分型和agrⅢ型为主，对于非血液来源的标本以agrⅠ型为主，与文献报道有相似之处，但本研究中agr未分型菌株较多，可能原因是agr自然突变导致，也可能是多重PCR不能扩增这些agr型别。由于agr多态性都集中在agrC的后半部分，整个agrD以及agrB的前半部分，接下来，我们将通过PCR扩增具有多态性的agr全长约1 000 bp的DNA片段，扩增阳性进行测序判断agr型别，阴性则认为是agr自然突变株。

本研究通过多重PCR对临床分离表皮葡萄球菌进行agr分型，并从耐药和标本来源两方面分析了表皮葡萄球菌agr基因多态性的差异，为了解临床分离表皮葡萄球菌的分子特征奠定了基础。

[1]Rogers KL,Fey PD,Rupp ME.Coagulase-negative staphylococcal infections[J].Infect Dis Clin North Am,2009,23(1):73.

[2]Dai L,Yang L,Parsons C,et al.Staphylococcus epidermidis recovered from indwelling catheters exhibit enhanced biofilm dispersal and "self-renewal" through downregulation of agr[J].BMC Microbiol,2012,12:102.

[3]Dufour P,Jarraud S,Vandenesch F,et al.High genetic variability of the agr locus in Staphylococcus species[J].J Bacteriol,2002,184(4):1180.

[4]Li M,Guan M,Jiang XF,et al.Genetic polymorphism of the accessory gene regulator (agr) locus in Staphylococcus epidermidis and its association with pathogenicity[J].J Med Microbiol,2004,53:545.

[5]Mertens A,Ghebremedhin B.Genetic determinants and biofilm formation of clinical Staphylococcus epidermidis isolates from blood cultures and indwelling devises[J].Eur J Microbiol Immunol,2013,3(2):111.

[6]Lina G,Boutite F,Tristan A,et al.Bacterial competition for human nasal cavity colonization:role of Staphylococcal agr alleles[J].Appl Environ Microbiol,2003,69(1):18.

[7]Cheung GY,Otto M.Understanding the significance of Staphylococcus epidermidis bacteremia in babies and children[J].Curr Opin Infect Dis,2010,23(3):208.

[8]Otto M.Molecular basis of Staphylococcus epidermidis infections[J].Semin Immunopathol,2012,34(2):201.

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摘要：目的探讨临床分离表皮葡萄球菌附属基因调节因子agr基因多态性，了解表皮葡萄球菌的分子特征。方法收集84株临床分离并经过全自动微生物鉴定系统准确鉴定的表皮葡萄球菌，通过PCR扩增esp和mecA基因准确鉴定和区分甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE)和耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)，采用多重PCR扩增表皮葡萄球菌 的agr等位基因，分析agr基因多态性。结果84株临床分离表皮葡萄球菌中，20株为MSSE，占23.80%，其中agr Ⅰ型5株，agr Ⅱ型2株，agr Ⅲ型2株，agr未分型11株。64株为MRSE，占76.20%，其中agr Ⅰ型37株，agr Ⅱ型7株，agr Ⅲ型11株，agr未分型9株。血液来源的表皮葡萄球菌中，agr Ⅰ型25株，agr Ⅱ型5株，agr Ⅲ型10株，agr未分型16株。非血液来源的表皮葡萄球菌中，agr Ⅰ型17株，agr Ⅱ型4株，agr Ⅲ型3株，agr未分型4株。结论临床分离表皮葡萄球菌agr基因存在明显多态性，MSSE中未分型agr较常见，MRSE中以agr Ⅰ型和agrⅢ型为主。

关键词：表皮葡萄球菌；附属基因调节因子；基因多态性；耐甲氧西林表皮葡萄球菌

Gene polymorphism of the accessory gene regulator (agr) inStaphylococcusepidermidisisolated from clinical samplesYANGYong-chang,XIAODai-wen,CHENLiang,etal.(ClinicalLaboratoryDepartment,SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital,Chengdu610072,China)

Abstract:ObjectiveTo study gene polymorphism of the accessory gene regulator (agr) in clinically isolated Staphylococcus epidermidis(S.epidermidis),and to find the molecular characteristic of S.epidermidis.Methods84 strains of S.epidermidis identified accurately by full automation microbiological identification system were collected,and PCR was used to amplify esp and mecA gene to differentiate methicillin-resistant S.epidermidis (MRSE) and methicillin-sensitive S.epidermidis (MSSE).Agr typing of clinically isolated S.epidermidis was performed by multiplex PCR.ResultsAmong the strains,20 strains were MSSE,which occupied for 23.80%,and 5 strains belonged to agr type Ⅰ,2 strains belonged to agr type Ⅱ,2 strains belonged to agr type Ⅲ,and 11 strains belonged to non-typable agr type.While 64 strains were MRSE,occupied for 76.20%,and 37 strains belonged to agr type Ⅰ,7 strains belonged to agr type Ⅱ,11 strains belonged to agr type Ⅲ,and 9 strains belonged to non-typable agr type.Among strains isolated from blood culture,25 strains belonged to agr type Ⅰ,5 strains belonged to agr type Ⅱ,10 strains belonged to agr type Ⅲ,and 16 strains belonged to non-typable agr type.As for strains isolated from non-blood samples,17 strains belonged to agr type Ⅰ,4 strains belonged to agr type Ⅱ,3 strains belonged to agr type Ⅲ,and 4 strains belonged to non-typable agr type.Conclusionagr polymorphisms of the accessory gene regulator (agr) are found in clinically isolated S.epidermidis,and agr type Ⅰ and Ⅲ are prevalent among MRSE,while non-typable agr type is common in MSSE strains.

Key words:S.epidermidis;accessory gene regulator;gene polymorphism;methicillin-resistant S.epidermidis

收稿日期：(2014-06-07)

作者简介：杨永长(1977-)，男，四川南充人，硕士，四川省医学科学院·四川省人民医院主管技师，主要从事临床微生物研究；黄文芳(1957-)，男，四川资中人，博士，硕士导师，四川省医学科学院·四川省人民医院研究员，主要从事临床检验研究。

文献标识码：A

中图分类号：R378.1+1

文章编号：1007-4287(2015)04-0587-04

通讯作者*