丹参酮ⅡA纳米粒对肝癌小鼠p38MAPK、TGFβ1及Cyclin E蛋白表达的影响

田锋奇, 张文周, 赵秀莉

(郑州大学附属肿瘤医院 药学部, 河南 郑州, 450003)

论著

丹参酮ⅡA纳米粒对肝癌小鼠p38MAPK、TGFβ1及Cyclin E蛋白表达的影响

田锋奇, 张文周, 赵秀莉

(郑州大学附属肿瘤医院 药学部, 河南 郑州, 450003)

摘要:目的观察丹参酮ⅡA纳米粒对肝癌小鼠p38有丝分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、转化生长因子β1(TGFβ1)及细胞周期素E (Cyclin E)蛋白表达的影响。方法60只小鼠制备肝癌模型后随机分为6组，分别给予生理盐水以及等体积的空白纳米粒、丹参酮ⅡA、不同剂量丹参酮ⅡA纳米粒。观察各组肿瘤抑制率及p38MAPK、TGFβ1、Cyclin E蛋白的表达。结果各给药组瘤体质量均较对照组显著缩小(P<0.01), 且高剂量组肿瘤抑制率显著高于丹参酮ⅡA 组及低剂量组(P<0.01); 给药后各给药组p38MAPK、TGFβ1及Cyclin E阳性表达率均显著高于或低于对照组及空白载体组(P<0.01), 各剂量丹参酮ⅡA纳米粒组与丹参酮ⅡA组差异显著(P<0.01), 且随着剂量增加，表达水平呈现逐步升高或降低趋势，组间差异显著(P<0.01)。结论丹参酮ⅡA纳米粒较丹参酮ⅡA具有更显著的抗肿瘤功效，可能与上调p38MAPK蛋白表达，下调TGFβ1及Cyclin E蛋白表达有关。

关键词:肝癌; 丹参酮ⅡA; 纳米粒; 转化生长因子β1; p38有丝分裂原活化蛋白激酶; 细胞周期素E

肝癌在中国具有较高的发病率，但手术切除率仅为20%左右。p38有丝分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)是MAPK家族的成员之一，介导细胞的生长、分化、分裂及凋亡等过程，与肿瘤的发生发展密切相关[1-3]。转化生长因子β1(TGFβ1)对细胞增殖具有重要的调控作用，且可激活p38等多种MAPK。细胞周期素E(Cyclin E)是G1期细胞增殖信号蛋白，其高表达可以缩短G1期，诱发肿瘤。丹参酮ⅡA是丹参的主要有效成分之一，对多种癌细胞具有杀伤作用，但丹参酮ⅡA不溶于水，这对其临床应用造成较大阻碍。纳米粒载药系统具有良好的缓释性和靶向性，近年来得到广泛应用[4-5]。本研究观察了丹参酮ⅡA纳米粒对肝癌小鼠p38MAPK、TGFβ1及Cyclin E蛋白表达的影响，现报告如下。

1材料与方法

1.1　动物和瘤株

雄性清洁小鼠60只，体质量18～22 g, 购自河南省实验动物中心；小鼠肝癌H22细胞株由郑州大学附属肿瘤医院实验室保存。

1.2　药物和试剂

丹参酮ⅡA购自成都瑞芬思生物科技有限公司，丹参酮ⅡA纳米粒由本院制备，载药量为1.8%, 兔抗鼠p38、TGFβ1、Cyclin E单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，免疫组化及DAB试剂盒购自深圳市科润达生物工程有限公司，倒置相差显微镜购自日本Olympus公司。

1.3　方法

1.3.1肝癌模型制备：将冻存的瘤株复苏，培养至对数生长期后，接种于小鼠腋下(浓度为1×107/mL), 肿瘤生长至1 cm时进行原位移植，方法如下：在无菌状态下剥取癌组织，切片备用。小鼠麻醉后常规消毒，手术暴露肝叶，沿其平面制作一条大约2 mm深的隧道，将剥取的癌组织送入其中，止血后缝合腹部切口。

1.3.2分组及给药方法：造模后12 d，将小鼠随机分为对照组8只，空白载体组10只，丹参酮ⅡA组9只、丹参酮ⅡA纳米粒低剂量组11只、中剂量组10只及高剂量组12只，分别尾静脉注射生理盐水25 mL/kg、空白纳米制剂125 mg/kg、丹参酮ⅡA 2 mg/kg、丹参酮ⅡA含量分别为1 mg/kg、2 mg/kg、4 mg/kg的丹参酮ⅡA纳米粒。1次/d, 连续给药1周，末次给药24 h后，处死小鼠。

1.3.3检测方法：以免疫组化法检测相关蛋白表达，石蜡切片包埋，抗原修复后加入非免疫性动物血清50 μL, 室温孵育10 min后，滴加单克隆抗体过夜，PBS溶液冲洗3 min×3次，加入生物素化羊抗兔IgG，孵育30 min后PBS冲洗。DAB溶液显色，流水冲洗。苏木素复染，脱水后固定。

1.4　观察指标

比较各组瘤体质量及肿瘤抑制率差异；观察肿瘤组织中p38MAPK、TGFβ1及Cyclin E蛋白阳性表达率的差异。

1.5　判定标准

肿瘤抑制率判定：处死小鼠后取出肿瘤组织称重，肿瘤抑制率=(对照组平均瘤体质量-治疗组平均瘤体质量)/对照组平均瘤体质量×100%。

蛋白阳性表达判定：以细胞核或细胞质呈棕黄或棕褐色判断为阳性细胞，每张切片由2名经验丰富的病理医师双盲阅片，于高倍镜下任选10个视野，计数阳性细胞数，阳性表达率=(表达阳性细胞数/总细胞数)×100%。

2结果

2.1　各组瘤体质量及肿瘤抑制率比较

经统计学分析，空白载体组瘤体质量与对照组无显著差异(P>0.05), 其余各组均较对照组显著缩小(P<0.01), 且随着丹参酮ⅡA纳米粒剂量增加，瘤体质量呈现减轻趋势，组间差异显著(P<0.01), 等剂量的丹参酮ⅡA纳米粒组较丹参酮ⅡA组瘤体质量显著减少(P<0.01)。见表1。丹参酮ⅡA组、低、中、高剂量丹参酮ⅡA纳米粒组的抑瘤率分别为63.54%、65.33%、72.94%、82.56%，其中高剂量组显著高于丹参酮ⅡA组及低剂量组(P<0.01)。

±s)　g

与对照组比较，**P<0.01;

与丹参酮ⅡA组比较，##P<0.01;

与丹参酮ⅡA纳米粒低剂量组比较，△△P<0.01;

与中剂量组比较，▲▲P<0.01。

2.2　各组肿瘤组织中p38MAPK、TGFβ1及Cyclin E蛋白表达特征及阳性率比较

p38MAPK主要在细胞质或细胞核中表达，TGFβ1及Cyclin E蛋白主要在细胞核中表达，呈棕黄色或棕褐色。见图1。各给药组p38MAPK阳性表达率均显著高于对照组及空白载体组(P<0.01)，各剂量丹参酮ⅡA纳米粒组均显著高于丹参酮ⅡA组(P<0.01)，且随着剂量增加，表达水平呈现逐步升高趋势，组间差异显著(P<0.01); 各给药组TGFβ1及Cyclin E阳性表达率显著低于对照组及空白载体组(P<0.01), 各剂量丹参酮ⅡA纳米粒组均显著低于丹参酮ⅡA组(P<0.01), 且随着剂量增加，表达水平呈现逐步降低趋势，组间差异显著(P<0.01)。见表2。

A.p38MAPK表达;B.TGFβ1表达;C.CyclinE表达图1 各指标蛋白表达特征

±s)　%

与对照组比较，**P<0.01; 与丹参酮ⅡA组比较，##P<0.01; 与丹参酮ⅡA纳米粒低剂量组比较, △△P<0.01;

与中剂量组比较，▲▲P<0.01。

2.3　相关性分析

经Pearson相关性分析, p38MAPK与TGFβ1表达呈负相关(r=-0.595,P<0.01), 与Cyclin E之间无显著相关性。见图2。

图2 p38MAPK与TGFβ1表达相关趋势图

3讨论

丹参酮ⅡA为中药丹参提取物，研究表明，其对乳腺癌、肝癌、胃癌、白血病等多种肿瘤细胞具有细胞毒性作用，具体抗肿瘤机制可能包括[6-7]: ① 抑制DNA合成，从而抑制肿瘤细胞增殖; ② 调节细胞周期，延长细胞周期中G0/G1比例，从而抑制肿瘤细胞增殖; ③ 上调p53等凋亡相关基因的表达，促进肿瘤细胞凋亡; ④ 抑制bcl-2等原癌基因表达，从而抑制肿瘤细胞增殖; ⑤ 下调血管内皮生长因子、细胞分裂促进因子的表达等，抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡。丹参酮ⅡA的水溶性较差，较大程度上限制了其生物利用度及在抗肿瘤领域的临床应用，因此，寻求合适的载药系统对提高其生物利用度具有重要意义。纳米粒是抗肿瘤等多种药物的理想载体，具有较好的可降解性及生物相容性[8-9], 近年来越来越多地应用于丹参酮ⅡA的制备。

p38MAPK是MAPK家族成员之一，细胞外多种应激原均可引发该家族的连锁反应，影响细胞内基因转录和蛋白合成等生物学效应，多种抗癌药诱导肿瘤细胞凋亡均通过活化p38MAPK实现。目前认为p38MAPK可能通过增强c-myc表达、磷酸化p53、参与Fas/FasL介导的凋亡通路等途径，实现诱导细胞凋亡的目标[10]。王炎等[11]研究认为，p38MAPK可诱导人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡，延缓细胞周期，其机制可能是通过p38MAPK信号转导通路上调凋亡相关基因表达来实现。TGFβ1/Smads信号转导通路是调控细胞增殖的重要系统，是机体抗肿瘤的关键环节。研究表明，肝癌发生发展过程中存在着该信号转导通路异常引起的细胞异常增殖及凋亡障碍。李琦等[12]研究表明, TGFβ1能够抑制小鼠肝癌生长，延长生存期，可能与其上调p38MAPK表达并抑制TGFβ1表达有关。Cyclin E是细胞G1向S期过度的调节因子，在生长信号的刺激下，细胞内Cyclin E蛋白表达上调，转化为活化的复合物状态，促进转录及DNA复制。Cyclin E蛋白过表达的肿瘤患者生存率显著低于低表达患者，因此其可作为肿瘤预后的预测因子。研究表明, Cyclin E在肝细胞肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且分化越差、临床分期越晚，其表达水平越高[13]。

本研究结果表明，各给药组小鼠的瘤体质量均较对照组显著减轻，提示丹参酮ⅡA及其纳米粒均有确切的抗肿瘤功效，而丹参酮ⅡA纳米粒的效果更加显著，这可能与纳米粒载药系统具有更好的靶向性、缓释性，从而有效提高药物的生物利用度有关；同时，本研究发现丹参酮ⅡA纳米粒对p38MAPK、TGFβ1及Cyclin E蛋白表达具有显著调节功能，提示其可能通过上调p38MAPK信号通路、下调TGFβ1及Cyclin E蛋白表达抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡，与上述报道一致。此外，本研究还发现，p38MAPK与TGFβ1的表达呈负相关，但其具体作用机制有待进一步研究证实。

参考文献

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Influence of tanshinone ⅡA nanoparticles on the

expressions of p38MAPK, TGFβ1and Cyclin E

proteins in mice with hepatic cancer

TIAN Fengqi, ZHANG Wenzhou, ZHAO Xiuli

(DepartmentofPharmacy,TumorHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan, 450003)

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the influence of tanshinone ⅡA nanoparticles on the expressions of p38 mitosis mitogen-activated protein kinase (p38MAPK), transforming growth factor β1 (TGFβ1) and Cyclin E proteins in mice with hepatic cancer. MethodsA total of 60 established mice models with hepatic cancer were randomly divided into 6 groups and respectively treated with normal saline and equivoluminal blank nanoparticles, tanshinone ⅡA and different-concentrations of tanshinone ⅡA nanoparticles. Tumor inhibiting rates and expressions of p38MAPK, TGFβ1 and Cyclin E proteins in both groups were observed. ResultsThe tumor body mass decreased significantly in each drug-treated group than in control group (P<0.01), and the high-dose group was significantly higher than tanshinone ⅡA group and low-dose group in tumor inhibiting rate (P<0.01). After drug administration, the positive expression rates of p38MAPK, TGFβ1 and Cyclin E proteins in each drug-treated group were significantly higher or lower than the control group or blank vector group (P<0.01). In addition, there were significant differences between each dose groups and tanshinone ⅡA group (P<0.01), and their expression levels showed gradually increasing or decreasing trend along with the increase of Tanshinone ⅡA dose, and the differences among groups were significant (P<0.01). ConclusionTanshinone ⅡA nanoparticles are more effective than tanshinone ⅡA in treatment of tumor, which is associated with up-regulating the expression of p38MAPK protein and down-regulating the expressions of TGFβ1 and Cyclin E proteins.

KEYWORDS:hepatic cancer; tanshinone ⅡA nanoparticles; transforming growth factor β1; p38 mitosis mitogen-activated protein kinase; Cyclin E

通信作者:赵秀莉, E-mail: hnzhaoxl@126.com

基金项目:中国高校医学期刊临床专项资金(11521465)

收稿日期:2015-03-05

中图分类号:R 735.7

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)11-001-04

DOI:10.7619/jcmp.201511001