脱细胞真皮基质血管化研究进展

林梦媛综述，夏德林审校

(泸州医学院附属口腔医院颌面外科，四川泸州646000)

脱细胞真皮基质血管化研究进展

林梦媛综述，夏德林审校

(泸州医学院附属口腔医院颌面外科，四川泸州646000)

组织创伤及缺损常常导致器官功能障碍和外形破坏，精确的修复重建在未来仍将是一个重大的医疗问题。20世纪90年代，脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix，ADM)首次成功用于皮肤缺损的修复，随后被迅速推广于临床[1，2]。但是ADM仅是一种皮肤替代品，与真正的活体皮肤在结构和功能上有非常大的差异。ADM移植后可减少瘢痕形成与色素沉着，改善受皮区创面愈合后的柔韧性和弹性。但与自体皮肤移植相比，真皮替代物的血管化进程仍明显偏慢，大大限制了ADM的临床应用。在治疗较大面积的皮肤缺损和深度损伤时，血供问题常常导致治疗失败[3]。因此，早期、快速血管化是ADM在整复外科领域中实现更好发展的保障。本文就ADM的血管化研究现状做一综述。

1 ADM的结构特点

ADM是指用化学或物理方法去除皮肤的表皮成分（角质细胞，汗腺，皮脂腺）和真皮成分（成纤维细胞，血管内皮细胞，平滑肌细胞）后，保留真皮内的细胞外基质,维持完整的胶原形态和基底膜的一种真皮替代物。因此其基本成分主要包括细胞外基质、弹性蛋白、胶原成分（Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原、Ⅶ型胶原）和极少量的细胞相关抗原（包括HLAABC、HLA-DR、Vimentin、Desmin、Talin等）[4]。

目前，ADM的制备方法主要有三类：①生物学酶（胰蛋白酶，中性蛋白酶和核酸酶等）消化法;②物理学的反复冻融法（利用组织内源性酶）;③化学去污剂法（SDS,EDTA,Triton-100等）或高渗盐法[5]。大量研究认为ADM植入活体后，成纤维细胞的黏附生长与残存的基底膜结构有密切关系，所以在ADM制作过程中，尽可能完整地保留基底膜。ADM的基底膜复合物可以形成基底膜与真皮两个面，基底膜面可诱导上皮细胞的移行和定植，有利于ADM的上皮化，真皮面有利于快速血管化。同时，ADM中疏松有序的胶原结构能诱导宿主细胞的良性迁移，最终完成受损组织的重构。体外实验也发现，有序的胶原结构能促进血管内皮细胞黏附，从而促进血管生长。

2 ADM的血管化研究

ADM血管化速率主要取决于移植早期能否及时获得血浆、组织渗液的营养供应，使周围的内皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞等其它细胞因子能及时长入。由于ADM去除了皮脂腺、毛发、血管、汗腺成分，具有密集的孔隙，因此植入宿主体内后，血管内皮能较快渗透进去，从而实现血管化，为周围自体皮或自体细胞生长提供充足的营养，这是ADM相比其它同类材料最大的优势。Kristin等[6]通过在几内亚猪腹部人为制造腹部切口疝，然后分别用人脱细胞真皮基质(Human acellular dermal matrix,HADM)和猪脱细胞真皮基质(porcine acellular dermal matrix，PADM)修复切口疝，结果发现HADM比PADM更容易与活体组织融合生长，其主要原因是在移植后，前者的血管化及细胞渗透速度更快。目前ADM的血管化研究主要分为以下几方面。

2.1 ADM的物理特性对血管化的影响

ADM孔隙的大小、密度不规则。扫描电镜下呈现出凹凸不平的非连续腔隙结构，此结构是其移植早期获得血浆、组织渗液以及其他营养因子的基础。由于ADM是加工处理而成的真皮替代产品，其孔径的大小与活体真皮存在差异[7]。因此，其孔径和间距分别为多大时才最有利于血管化和组织修复，目前尚无统一结论。Burke等在胶原—氨基葡聚糖(glycosaminoglycan，GAG)膜上种植表皮细胞发现，真皮支架表面孔径小于培养细胞直径(15～20 μm)，更有利于细胞生长、分化。但之后的研究结论与此相反，Pruitt等[8]认为只有ADM孔径大于80 μm以后，周围组织的内皮细胞、淋巴细胞以及生长因子才能顺利渗透进入ADM，从而实现血管化。但有一点是被公认的：ADM越薄，组织液越容易渗透进去，从而促进血管化，反之则阻碍ADM血管化。目前商品化的ADM厚度多为0.2 mm，多数认为在移植时自体皮片加ADM的总厚度不超过0.7 mm更有利于移植成活。

2.2 促血管生长因子对ADM血管化的影响

血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种非常强效的内皮细胞有丝分裂促进剂，具有极强的促进血管增生的能力，可刺激内皮细胞在体外形成血管样结构。VEGF有多种同型异构体，其中主要有VEGF 121、VEGF 165、VEGF 145、VEGF189、VEGF206等。各种VEGF异构体都具有促进血管再生的能力，其中VEGF165促进血管再生的能力最强，在组织工程组织血管化过程中被广泛应用。

李菲菲等[9]将胎儿ADM包埋在SD大鼠背部皮下，实验组在包埋区皮下滴加血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），空白组只做ADM包埋，在术后不同时间点分别取材，通过免疫组织化学方法，发现在术后6周，实验组血管密度明显高于空白组，预示了VEGF能在宿主体内促进ADM的血管化，具有潜在的应用价值。贺立新等[10]通过体外实验，将VEGF165基因转染到鼠成纤维细胞后，再把此成纤维细胞接种于异种ADM表面，然后用10%的小牛血清体外培养1周，形成成纤维细胞—ADM的真皮替代物。在SD大鼠背部切取3 cm×4 cm的全厚皮片，将成纤维细胞一异种脱细胞真皮埋植在皮片缺损区，然后将皮片覆盖在成纤维细胞异种脱细胞真皮表面，术后不同时间点观察术区愈合情况。结果发现：与对照组相比，成纤维细胞—ADM提高了皮片成活率，术后第4周可见实验组异种脱细胞真皮结构中毛细血管数量明显多于对照组。类似实验，通过手术，在豚鼠背部造成2 cm×2 cm的全层皮肤缺损区域，然后植入ADM，表面覆盖自体断层皮片并缝合，在ADM深面注射囊化VEGF165—NIH3T3细胞，术后两周，通过免疫组化方法发现实验组微血管密度明显高于对照组，实验组皮片成活率明显提高[11]。这些结果都说明了VEGF在促进ADM血管化方面有显著效果。

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)属于FGF家族(23个已知成员)，是一种肝素结合生长因子。能够促进包括间叶细胞和血管内皮细胞在内的一系列细胞的增殖，刺激成纤维细胞和毛细血管内皮管腔的形成，在体内具有潜在的促血管生成活性。Tepper等[12]在体内和体外实验中利用电磁场的作用促进内皮细胞分泌出bFGF,实验结果显示bFGF能促进血管生长和形成。此外，bFGF在伤口愈合和组织修复中发挥着重要。但是目前还未见bFGF运用在ADM的相关研究。

2.3 血管化种子细胞对ADM血管化的影响

内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC)和血管内皮细胞是最终分化为血管的主要细胞[13,14]。研究认为，能分化为血管的EPC表面标记物主要有CD31，CD34,Tie-2。在正常情况下EPC保持低增殖活性，在组织损伤后，EPC能分化形成血管等新的组织结构。进入循环系统中的内皮祖细胞(circulating endothelial progenitor,CEP)具有较高的增殖潜能，研究证实，在四肢缺血、心肌缺血，视网膜缺血以及胰腺缺血后，体内应用CEP能有效促进损伤区血管生长[15-17]。因此，ECP和CEP在组织工程血管化方面的应用具有潜在价值，但目前没有将二者用于ADM的相关报道。

早在1998年，Black等[18]将人脐静脉内皮细胞和真皮成纤维细胞培养在胶原粘多糖（collagen-glycosaminoglycan）高分子聚合物支架上，成功诱导支架内皮化。随后，Supp等[3]通过基因改造，让角质细胞高表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）后，将其种植在皮肤替代物表面，然后将皮肤替代物移植在裸鼠皮下，结果显示其促进了皮肤替代物血管化。为了解决异体细胞引起的排斥反应，Sahota等[19]从需要皮肤修复手术的患者体表取下少量皮肤组织，运用胶原酶消化法分离出微血管内皮细胞（human dermal microvascular endothelial cells，HuDMECs）、角化细胞、成纤维细胞后，在体外环境中让三者同时生长黏附在人ADM材料上，形成ADM复合物，然后将ADM复合物进行自体移植。通过观察发现：在体外培养2周左右，HuDMECs渗透入ADM的量最合适，即适合移植入活体，术后随访发现移植的ADM复合物生长良好，修复效果满意。将人内皮细胞单独培养在二维培养基中，容易丧失其分化潜能，为了观察内皮细胞早期管状出芽情况，Wenger等[20]将人脐静脉内皮细胞和成骨细胞混合培养于胶原支架上，使其生长形成类球体，最终诱导出新生血管，使胶原支架血管化。2003年王军琳等[21]通过在ADM材料上培养人血管内皮细胞加速了ADM血管化。汪道新等[22]通过实验，在猪的背侧剃毛后，切除皮肤全层，手术造成大小为5 cm×5 cm的圆形皮肤缺损区域，然后植入ADM，在ADM下方注射人脐静脉内皮细胞悬液1 mL，约含细胞2×106个，其上覆盖自体皮肤后封闭伤口，术后7 d发现术区血管化数目明显多于对照组。杨家骥等[23]用人脐静脉内皮细胞复合猪ADM构建出富含血管化结构的真皮替代物，然后移植在裸鼠皮下，移植后3周，HE结果显示，对照组无血管形成，而实验组有大量血管样结构形成。脐静脉血管内皮细胞和成纤维细胞共培养在ADM材料上，制成ADM复合物，然后移植在裸鼠背部皮肤下，作者用自制的极低频电磁刺激仪分别在体外、体内实验两个阶段刺激ADM复合物上面的细胞，结果发现极低频电磁场不仅促进成纤维细胞和血管内皮细胞共培养体系形成血管结构，并且促进与宿主血管相吻合。因此，在体外构建出由ADM复合人脐静脉内皮细胞含血管样结构的组织工程真皮，能在移植进入动物体内后提高修复区组织的血管形成速度，进而提高移植成功率，极低频电磁场能有效促进这一过程[24]。虽然这类方法目前取得了一定进展，但是血管内皮细胞在支架材料上存活较低、易凋亡，因此，仍然需要进一步探索更为有效的ADM血管化方法。

3 展望

脱细胞真皮基质在临床应用中，其内部结构血管化是ADM移植是否成活的关键。因此，充分理解ADM在体内、体外血管化的具体机制，有利于进一步探索新的促进ADM血管化的策略，提高它在活体移植的成功率。虽然ADM已经广泛应用于临床，但它毕竟是一种缺乏活体细胞的真皮替代产品，要实现与活体组织的完美融合，甚至实现活体皮肤的功能，仍然有很多问题需要解决。首先应该进一步探索材料的孔径大小及孔径密度，以使血管化达到最佳。同时优化ADM的制作方法、开发新的打孔技术，使材料的物理特性和生物学特性更符合血管化要求。第二方面，进一步探索ADM血管化的分子机制，寻找新的蛋白或基因调控靶点，从而建立新的促血管化方法。除此之外，3D生物打印技术是目前新兴的学科，根据已有报道，它已经成功应用于修复外科领域，特别是骨骼、皮肤修复方面[25-27]。应用这个手段，结合细胞生物技术、高分子材料技术，将来可能会在组织修复，包括ADM血管化方面有所突破[28]。本文通过归纳目前实现ADM血管化的主要方法和相应进展，旨在为ADM血管化相关研究提供线索和思路。

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（2014-10-10收稿）

R783.9

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.02.030

林梦媛（1987-），女，住院医师，硕士研究生，E-mail：497313477@qq.com