埃博拉病毒免疫学致病机制研究进展

刘 赛，张永宏

2014年2月起暴发的西非埃博拉病毒病（Ebola virusdisease,EVD）疫情，截至2015年1月4日确诊或疑似病例已有20 747例，其中8235人丧生[1]。2014年8月8日，WHO宣布本次EVD疫情已经成为国际公共卫生紧急状况。本病目前尚无特异性治疗方法，亦无有效疫苗。因此，人体对于埃博拉病毒（E－bola virus,EBOV）的免疫反应可谓是对抗本病的最主要途径，也是发现有效治疗方法和开发疫苗的关键。因此，本文就EBOV属的免疫学致病机制进行综述。

1 病原学、流行病学和临床特点

本病病原为EBOV，属于纤维病毒科纤维病毒属，为单股负链RNA病毒，RNA不分节段。病毒呈纤维状，可呈杆状、丝状、“L”形等多种形态。病毒颗粒长度平均1000 nm，直径约100 nm。病毒有脂质包膜，包膜上有呈刷状排列的突起，主要由病毒糖蛋白组成。EBOV可分为扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型、塔伊森林型和莱斯顿型。除莱斯顿型仅有非人类灵长类动物致死记录外，其余4种亚型感染人类后均可致病（塔伊森林型仅有1例人类致病记录）。不同亚型病毒基因组核苷酸构成差异较大，但同一亚型的病毒基因组相对稳定。

EBOV主要传染源是感染EBOV的人和非人类灵长类动物，目前认为其自然宿主为狐蝠科的果蝠，但其在自然界的循环方式尚不清楚。本病最主要的传播途径是接触传播，可以通过接触患者和被感染动物的各种体液、分泌物、排泄物及其污染物感染，而患者感染后血液中可保持很高的病毒载量，如未能做好防护和隔离，易造成医院内传播，因此其为EVD暴发流行的重要因素。

本病潜伏期为2～21 d，一般为5～12 d。尚未发现本病在潜伏期有传染性。自然病程内常见症状为发热、恶心、呕吐、腹泻、皮疹、肤色改变、全身酸痛、出血等，感染者症状与同为纤维病毒科的马尔堡病毒感染症状极为相似。致死原因主要为心肌梗塞、低血容量性休克及多器官衰竭。主要病理改变为皮肤、黏膜和脏器的出血，多器官可见到灶性坏死。肝细胞点和灶样坏死是本病的典型特点，可见小包涵体和凋亡小体。目前对EVD尚缺乏特效治疗方法，主要是对症和支持治疗。

2 免疫学致病机制

接触感染性的体液或组织时，EBOV可通过损伤的皮肤或针刺伤口进入人体[2]。在易感动物模型中，有证据证明病毒可经由气溶胶方式经黏膜感染机体[3]。

病毒进入人体后，早期即可进入单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞（dendritic cells,DCs）复制，并诱发细胞因子和趋化因子的释放。病毒还可与这些细胞表面的凝集素受体结合，随这些细胞散播。体内试验显示出感染后髓样细胞触发受体1的快速表达，这将会导致细胞因子和趋化因子进一步释放[4]。同时单核细胞和巨噬细胞会过度表达细胞表面组织因子，促进凝血异常发生[5]。一项研究发现病死者血病毒载量往往达到1010copies/ml，而幸存者血病毒载量常常约为107copies/ml，提示病毒复制直接导致组织损伤也是疾病致死的重要一环[6]。

单核细胞和巨噬细胞感染后将大量分泌促炎性细胞因子和趋化因子，包括肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）－α、白细胞介素（interleukin,IL）－1、巨噬细胞炎性蛋白质（macrophage inflammatory protein,MIP）－1α及活性氮氧自由基，导致以正反馈形式募集更多单核细胞和巨噬细胞以及中性粒细胞至感染部位，并促进血管通透性增加及血管扩张[6]。病毒颗粒可诱导多形核细胞脱颗粒，加剧这种早期炎症反应，并激活这些多形核细胞。这样的早期炎症反应未必是完全有害的，它也有可能在早期帮助机体建立好的免疫反应趋势甚至免疫适应过程。扎伊尔型EVD病死者血清可检测到IL－1β、IL－1RΑ 、IL－6 、IL－8 、IL－15、IL－16、MIP－1α、MIP－1β、单核细胞趋化蛋白－1、巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞抑制因子、诱导蛋白－10、生长调节癌基因蛋白－α及嗜酸细胞活化趋化因子显著上升；存活者血清仅可测及 IL－1β、IL－6、MIP－1α 和 MIP－1β暂时性中度上升。苏丹型EVD病死者血清仅见IL－1β、IL－6、MIP－1α 和 MIP－1β 显著上升，其余细胞因子无明显变化；存活者中仅见干扰素（interferon,IFN）α上升。本迪布焦型EVD病死者中，可见IL－10显著上升，而 IL－1α、IL－1β、IL－6 和 TNF－α 水平反而下降；存活者中未见细胞因子水平有异常变化[7－10]。

另外，IFN在抗病毒和保护机体中起到重要的作用。而多项研究表明EBOV有减少IFN分泌以及阻断其作用通路的能力，因此对以DCs为主的多种免疫细胞的功能有巨大的影响，同时阻断了固有免疫和获得性免疫之间的重要通路。小鼠实验发现，本来对本病毒有高度抵抗能力的小鼠敲除IFNα/β受体或信号转导与转录激活子（signal transducer and activator of transcription,STAT）1或注射IFN抗体后会对本病毒易感，提示IFN为重要保护性因子[11]。现已发现2种病毒编码的蛋白——VP24和VP35，能影响IFN的作用[12－14]。VP24干扰STAT1的核聚集，以此阻断Ⅰ型IFN通路，导致被感染机体免疫系统对这一具有抗病毒作用的信号转导通路不敏感[13]。VP35阻断IFN调节因子－3，减弱IFN反应，同时减少 IFN α/β 生成[12,14－15]。因此，感染后的DCs不会分泌IFNα，也无法被完全激活成熟，同时Ⅰ型主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）表达下降。此外，IFN分泌减弱会导致自然杀伤细胞（natruralkiller cell,NK细胞）和iNKT细胞激活减弱[16]。已有研究指出，在小鼠体内实验中，敲除或用抗体阻滞NK细胞可导致小鼠对本病抵抗能力下降，可见NK细胞是一个重要的保护因素。

如前所述，DCs在感染过程中，尤其在死亡患者中，会出现Ⅰ型MHC表达下降以及抗原提呈能力严重下降的现象，提示获得性免疫同样会被削弱。现有观点认为病毒通过淋巴系统作为转运媒介，散播并感染内皮细胞及多种肝、肺和脾细胞，以利于进一步复制和传播[6，17]。然而病程稍早期可见淋巴细胞大量凋亡，这构成疾病致死过程的重要一环[18－20]。一项研究指出，多种分子机制促发这个现象，包括TNF相关凋亡诱导配体和Fas－FasL[18]。然而具体的机制仍在研究中，现有研究指出受感染的巨噬细胞分泌的一氧化氮可诱导凋亡的发生，而功能不全的DCs和整体上的免疫抑制状态加剧促发了这种现象[20]。

关于获得性免疫具体机制方面，在体液免疫环节中，病毒编码的EBOV糖蛋白（glycoprotein,GP）不仅帮助病毒出芽释放，还具有表位伪装和原子空间遮盖的作用。GP表面被大量N－和O－连接寡糖和唾液酸覆盖，帮助它达成以上2项功能[21－22]，使得中和抗体难以识别病毒特异性表位以中和病毒，抗原提呈细胞也因为抗原被遮挡以至于难以识别病毒抗原。

值得一提的是，病毒GP基因不仅编码GP，尚编码一种非病毒结构性的分泌性GP（secretory GP,sGP），其与GP共享一些抗原表位。前期研究曾怀疑sGP在细胞层面上有直接的免疫病理作用，如结合中心粒细胞，诱导淋巴细胞凋亡，增加血管通透性等功能，后续研究已将这些观点推翻[23－24]。近期研究主要集中在其于体液免疫中的角色和其对疫苗研发的影响。在转录水平上，sGP与GP产生定量比率约为2.8∶1，然而sGP为二聚体，GP为三聚体，再经过转录后修饰等环节，最终血浆中二者丰度比率为4.4∶1，考虑到二者共享部分抗原表位，高度提示sGP会大量结合GP抗体，致其滴度下降。研究中还发现，以GP作为免疫原免疫的动物模型中，一旦以sGP刺激，则抗GP效应下降，推测因为共享表位的存在，即便是以GP为免疫原免疫实验动物，实验动物体内仍会产生少量针对sGP表位的免疫细胞。一旦以sGP刺激后，大量扩增的sGP特异性免疫细胞会在数量上与GP特异性免疫细胞竞争，以至于危害GP特异性免疫细胞的存在[25－26]。因此可以推测，经GP源性疫苗免疫后的人类，可能在感染EBOV后，因sGP大量增生，而使免疫效果大打折扣。

尽管如此，利用生物工程技术，以不同病毒包装的GP疫苗能不同程度地诱导病毒特异性T和B淋巴细胞反应。经分析其血清抗体水平与生存率呈正相关，结合疫区将幸存患者血清用于后续出现的EVD患者这种疗法的成功经验，使部分研究者将目光投向体液免疫环节。前期试验包括使用KZ52单克隆抗体或其他多克隆抗体作为预防性或治疗性疫苗的最终效果并不如人意，推测可能是由于前述sGP抗体耗竭或GP抗原表位遮盖等作用[27－28]。然而类似于抗HIV的高效抗反转录病毒疗法，有研究使用3种表型无重叠的病毒特异性抗体（ZMAb）注射入已感染非人类灵长类动物，发现其有明显的保护性作用[29]。后续研究中发现，发病13周再次注射病毒后，6只动物中有2只死亡。研究2只死亡动物血样发现，其中缺乏CD4+IFNg+GP特异性T淋巴细胞，显示其未能建立特异性的病毒免疫记忆反应[30]可能与这种机制有很大关系。这也激励医学界深入关注多价单克隆抗体疗法对于本病的治疗作用，并且催生了ZMapp这种治疗性药物（即ZMAb和MB－003的合剂）的研发。近期的研究更是将ZMAb原理和其他药物（尤其基于上述免疫致病环节中的关键因子）联合，探讨其治疗作用。一项研究联合ZMAb和腺病毒载体的IFNα（Ad－IFN）治疗感染EBOV的实验动物，探讨其在病程不同阶段对短尾猴和恒河猴的治疗作用。研究发现，75%的短尾猴（感染后第 3天注射 Ad－IFN和 50 mg/kg的ZMAb）、50%的短尾猴（感染后第1天注射Ad－IFN，感染后第 4天注射 50 mg/kg的 ZMAb）和100%的恒河猴（感染后第3天注射Ad－IFN和50 mg/kg的ZMAb）获得病毒清除性存活（截至感染后第 28天）[31]。

至于主动免疫方面，多数研究所关注的特异性抗原表位主要也是GP。一项研究发现，利用扎伊尔型EBOV的GP上的MFL片段（氨基酸残基393～556），能诱导出较强的免疫反应，产生大量中和抗体。使用重组VSV载体制备的二价苏丹型EBOVGP及MFL片段疫苗可于小鼠体内诱导出抗扎伊尔型和苏丹型EBOV的交叉免疫力，并产生大量中和抗体[32]。另一项疫苗实验中（同样以VSV为载体，EBOV－GP为抗原），免疫后的小鼠（VSVΔG/EBOV－GP疫苗剂量2×104空斑形成单位）中，在不同时间节点使其感染小鼠适配的EBOV，6.5个月和9个月的生存率均为100%，12个月的为80%（12/15）。以其免疫豚鼠后（剂量2×105空斑形成单位），在不同时间节点使其感染豚鼠适配的EBOV，7个月的生存率为83%（5/6），12个月和18个月的均为100%。经分析实验数据得出，实验动物感染前，其血浆内仍存在EBOV－GP特异性IgG与生存率呈正相关[33]。

有几项研究结果则支持细胞免疫在获得性免疫中的地位。研究显示，CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和B淋巴细胞各自缺失的3组小鼠被注射病毒后，仅CD8+T淋巴细胞缺失组无小鼠存活，提示CD8+T淋巴细胞在细胞免疫过程中起到巨大作用[34－37]。另一项类似的灵长类动物实验中，以基于腺病毒的特异性疫苗主动免疫实验动物后，将其产生的特异性IgG浓缩后输入未免疫的同种动物时，仅能保护5只中的1只，而利用抗体消减已主动免疫的动物的CD8+T淋巴细胞后，5只中的4只免疫保护作用消失，而存活的1只血样中CD4+T淋巴细胞水平在5只中是最高的[38]。这不仅说明CD8+T淋巴细胞具有保护性作用，也从侧面反映出个体获得性免疫功能中各免疫细胞及其功能的平衡十分重要。

3 展 望

本次EVD疫情与以往有几点明显的不同：首先，本次疫情可谓是一次国际性疫情，不仅影响到西非多个国家，尚有病例输出到欧洲及美洲，造成全球性恐慌。然而也正是如此，吸引了国际医学界的广泛关注，以及政府等部门的大力投入。此外，值得注意的是，本次疫情流行毒株为致病性和病死率最高的扎伊尔型EBOV，然而，截至目前所有病例病死率为39.7%（根据WHO截至2015年1月4日报告的病例数[1]），远远低于既往疫情的50%～90%[39]，提示医疗经验累积和支持疗法的进步可能与本病病死率下降有关。在科研方面，对于免疫致病机制的研究和疫苗的研发有了长足进展[40－41]，尤其是特异性抗原表位多价单克隆抗体与补充病理状态下缺乏的因子相结合的靶向疗法在动物实验中显示出相当的治疗作用，为本病特异性疗法的开发带来了曙光。同时，主动免疫方面的研究肯定了多价疫苗的免疫保护效果，已具备Ⅱ期临床试验的条件。因此，在这种国与国之间、临床与科研之间协同合作的总体环境下，相信攻克EVD的战役拥有美好的明天。

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