西尼罗病毒感染免疫应答反应研究进展

王化磊，金宏丽，郑学星，杨松涛，夏咸柱

西尼罗病毒（WestNile virus,WNV）病是由WNV引起的急性发热性人兽共患传染病，可侵犯中枢神经系统，引起脑炎。病原可被划分为2个谱系，谱系1流行于非洲中部和北部、以色列、欧洲、印度、澳大利亚、美国中部和北部以及南美洲的哥伦比亚和阿根廷。谱系2主要在非洲中部、南部和马达加斯加流行。易感宿主包括鸟类、人、马、蝙蝠、臭鼬、花栗鼠和家兔等多种动物，犬和猫也偶有感染病例。近年来此病在人和动物中暴发频繁，给发病地区带来重大经济损失和健康威胁[1]，已被WHO和世界动物卫生组织列为全球重大流行病之一。

WNV属于黄病毒科黄病毒属日本脑炎病毒族病毒。WNV为单股正链RNA病毒，基因组首先翻译成一个多聚蛋白，进而被宿主和病毒的蛋白酶切割形成3个结构蛋白——衣壳蛋白、囊膜蛋白和前膜蛋白和7个非结构蛋白（nostructural protein,NS）——NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。结构蛋白主要参与病毒粒子的形成，NS主要与病毒复制、病毒组装和诱导宿主的先天性免疫应答相关。

WNV病的发病过程主要包括3个阶段：感染和传播、外周组织病毒扩散和入侵神经系统。动物宿主一旦被带病毒的蚊子叮咬，病毒首先在皮肤树突状细胞（dendritic cells,DCs）内复制，随后感染细胞转移至淋巴结，引起首次的病毒血症，进而感染脾脏和肾脏等器官。病毒血症扩散至内脏器官后，WNV可通过血脑屏障进入中枢神经系统（central nervous system,CNS），感染脑和脊髓，发展为致命性疾病。目前，WNV进入CNS的机制尚不完全清楚。

老人和免疫缺陷者更容易感染WNV，并易发展为脑炎。尽管其易感性的免疫原理尚未完全明确，但利用小鼠为感染模型，有关固有免疫和获得性免疫方面的研究结果表明：在易感人群体内，针对疫苗和保护反应的固有免疫和获得性免疫功能可能均下降[2]。本文针对WNV感染过程中激发的固有免疫和获得性免疫的研究进展进行综述。

1 固有免疫反应

1.1 固有免疫细胞

1.1.1 巨噬细胞 巨噬细胞可通过直接清除病毒、加强提呈抗原至T和B淋巴细胞、产生促炎或抗病毒细胞因子和炎症趋化因子等作用限制病毒感染[3]，缺失巨噬细胞的小鼠感染WNV后病情会加重。对于其他黄病毒如日本脑炎病毒，也有报道指出巨噬细胞可通过产生一氧化氮和其他活性氧中间物直接控制感染[4]，但此现象未在WNV感染中得到证实。在WNV感染过程中，巨噬细胞的活化可促进Ⅰ型干扰素（interferon,IFN）、肿瘤坏死因子（tumornecrosis factor,TNF）-α、白细胞介素（interleukin,IL）-1β、IL-8和其他一些细胞因子的释放，这些分子在体外被证明有抗病毒活性并可降低病毒复制[5]。

1.1.2 DCs 根据功能和表面分子不同，DCs分为浆细胞样 DCs（plasmacytoid DCs,pDCs）和髓样 DCs（myeloid DCs,mDCs）。pDCs无吞噬细胞功能，其捕获和提呈抗原至T淋巴细胞的效率较低，但在病毒和细菌存在下，pDCs可产生高水平的Ⅰ型IFN，因此在抗病毒免疫过程中有重要作用。WNV感染pDCs后，虽然病毒复制水平较低，但pDCs可快速产生高浓度的促炎细胞因子。这些细胞因子的产生不依赖病毒复制，而是依赖于胞内体Toll样受体（Toll-like receptors,TLR）7[6]。此外，不同宿主来源的WNV可影响pDCs的应答，例如在哺乳动物细胞中增殖的WNV感染pDCs后可诱导IFNα的产生，而在蚊细胞中增殖的WNV却不能诱导pDCs产生IFNα[7]。同pDCs相比，mDCs更易感染WNV，一方面可能会促进病毒传播，另一方面促进免疫系统活化。mDCs在骨髓内产生，分布于全身，作为专职的抗原提呈细胞，可将抗原从外周感染部位运输至淋巴组织，将感染信号提呈给T和B淋巴细胞，从而快速产生获得性免疫应答[8]。间接体内试验（又称回体法）中，mDCs感染WNV后，可产生强烈的Ⅰ型IFN和促炎细胞因子反应，但mDCs成熟后，其诱导能力下降[9]。有报道表明，缺失CD8α+mDCs后感染WNV时，交叉提呈和病毒特异性CD8+T淋巴细胞反应的能力均丧失[10]。皮肤中DCs亚群可在WNV感染时激发免疫反应，包括快速动用来源于骨髓的髓样细胞。

1.2 模式识别分子 宿主细胞可通过模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）识别病毒表面的病原相关分子模式，进而诱导机体产生抗病毒免疫，包括产生Ⅰ型IFN、IL-1β和促炎细胞因子，表达抗病毒基因，激活固有免疫敏感细胞，促进获得性免疫的产生等[9]。视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ（retinoic acid-inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ）样受体家族［RIG-Ⅰ和黑色素瘤分化相关抗原（melanoma differentiation-associated gene,MDA）5］和 TLR 家族（主要为TLR3和TLR7）是识别WNV的主要PRRs[10]。

RIG-Ⅰ和MDA5是细胞质RNA解旋酶，可识别ssRNA和dsRNA，通过衔接分子（IFN启动子刺激物-1）传导信号，激活 IFN调节基因（IFN regulatory factor,IRF）3和7的转录，诱导Ⅰ型IFN和抗病毒基因的转录[11]。敲除RIG-Ⅰ的小鼠胚胎成纤维细胞感染WNV后，IRF 3活化明显延迟，且伴随着细胞病变和病毒滴度的增加。感染WNV后48 h内MDA5水平会显著升高，但同对照细胞相比，敲除MDA5的DCs和巨噬细胞感染WNV后，Ⅰ型IFN水平仅有轻微降低，推测MDA5在感应WNV dsRNA时起辅助作用。缺失RIG-Ⅰ和MDA5的接头蛋白IPS-1后，炎症反应不可控制，也不能抵抗WNV感染[12]。

TLR3和TLR7为TLR家族成员，主要在胞内体中表达，分别可被dsRNA和ssRNA激活。TLR3可通过活化IRF3和核转录因子κB（nuclear factor κB,NF-κB），分别诱导Ⅰ型IFN和炎症细胞因子的产生。TLR3可参与WNV免疫发病机制，敲除TLR3的小鼠腹腔感染WNV后，外周病毒滴度增加，抗病毒和促炎细胞因子减少，小鼠死亡率降低。推测敲除TLR3后，可能由于外周炎症反应水平降低（TNF-α降低，而TNF-α可影响血脑屏障的完整性），血脑屏障保持完整性，进而阻碍病毒侵入中枢神经系统，因此小鼠存活率增加[13]。TLR7通过胞内接头蛋白髓样分化因子88（myeloid differentiation primary response gene 88,MyD88）进入信号通路活化阶段，活化IRF7和Ⅰ型IFN。就理论而言，TLR7和依赖IL-23的反应可调控免疫细胞到达被感染的细胞。敲除TLR7的小鼠和巨噬细胞感染WNV后，IL-12和IL-23反应降低，易发展为致死性西尼罗脑炎[14]。此外，皮肤感染后，TLR7介导的反应可促进朗格汉斯细胞的迁移[15]。

1.3 IFN 在病毒感染过程中，Ⅰ型IFN（包括IFN α和IFNβ）由WBC和实质性细胞分泌生成，在天然免疫反应中发挥重要作用[16]，可通过上调与抗病毒有关的基因，诱导抗病毒免疫，还可刺激DCs细胞成熟和直接激活B和T淋巴细胞[17]。小鼠体内或体外细胞培养物的实验表明，Ⅰ型IFN可在WNV感染早期通过阻止病毒复制和保护神经元控制病毒感染。细胞识别WNV后，可通过TLR3和TLR7受体产生Ⅰ型IFN，进而活化接头蛋白MyD88和转录因子IRF3和IRF7。在病毒感染早期，WNV RNA通过激活RIG-Ⅰ和MDA5，可诱导Ⅰ型IFN的产生[18]。人mDCs、pDCs和单核细胞来源的巨噬细胞感染WNV后，可分泌Ⅰ型IFN[7]。缺失IFNα/β受体的小鼠对WNV高度易感，病毒很快传入CNS内，导致100%的小鼠死亡[19]。此外，在Vero细胞中，提前或之后作用Ⅰ型IFN后，均可抑制WNV复制[20]。在小鼠原代神经元感染WNV之前或之后使用IFN β可通过干扰病毒复制，增加神经元的存活几率[19]。

Ⅱ型IFN（如IFNγ）主要由CD8+T淋巴细胞产生，也可由γδT淋巴细胞和自然杀伤细胞产生，可能在WNV感染的早期固有免疫中起作用。体内实验表明，IFNγ可在病毒感染早期限制WNV扩散进入CNS，敲除IFNγ或IFNγ受体基因的小鼠，其病毒血症加重，外周淋巴组织中病毒复制增加，病毒进入CNS的能力增强，致死率升高[21]。

近年来，第三种IFN被提及。以前命名为IL-28a/b和IL-29，后被归类为 IFN λ[16]。IFN λ3可作为重要的细胞因子控制黄病毒如HCV的感染[22]，但在其他黄病毒中IFNλ的作用研究较少，与WNV相关的文献仅有1篇。同Ⅰ型IFN作用相似，IFNλ可阻止WNV病毒样粒子（经基因改造的WNV，仅可进行单周期感染）感染易感细胞，但如果提前加入IFNλ，则不能抑制病毒复制[23]。

2 获得性免疫反应

2.1 体液免疫反应 机体抵抗WNV感染的过程中，体液免疫发挥关键性作用。B淋巴细胞缺陷小鼠感染WNV后，其CNS内可检测到高滴度的病毒，并可引起小鼠100%死亡[24]，这可能与机体不能有效清除外周的病毒有关。机体感染WNV后，固有免疫活化B淋巴细胞的过程须通过Ⅰ型IFNα/β受体的信号通路，此通路是在淋巴窦中实现，而不是在脾中实现[25]。研究表明，缺失MyD88的小鼠在感染WNV后，小鼠体内B淋巴细胞活化、生发中心激活和记忆性B淋巴细胞反应等方面均有缺陷[26]。多种基因缺陷会影响抗病毒抗体的活化、产生和运输，从而导致抗体滴度和存活率下降[27]。

小鼠感染WNV后，其脑内浆细胞会增加[28]，可能是与CNS内IgG发挥抗病毒作用有关。将具有中和活性的单克隆抗体或多克隆IgG注射正常小鼠，

可抵抗WNV的致死性攻击，如果注射μMT小鼠，可延长其存活时间[29]，但在WNV感染初期，抗体起的作用未知。为了评价抗体疗法的可能性，μMT小鼠感染病毒2 d后注射人丙种球蛋白，小鼠存活时间增加。丧失分泌IgM功能的小鼠（sIgM－/－小鼠，但细胞表面可表达IgM），感染WNV后会全部死亡[29]。将抗WNV IgM抗体（免疫后4 d获得）或抗WNV IgG抗体被动转移入正常小鼠或sIgM－/－小鼠体内，可限制病毒的扩散。因此，早期的抗WNV IgM抗体反应可限制病毒在外周和CNS内的传播，且在感染后4 d体内IgM水平可预测存活结果[30]。

2.1.1 记忆性免疫应答 感染WNV后[24]或免疫预防[31]时，特异性IgG的产生极其重要。然而WNV感染时，有关记忆性应答反应的研究较少。免疫小鼠体内，记忆性B淋巴细胞（memory B cells,MBCs）和长寿命浆细胞（long－lived plasma cells,LLPCs）可长期存在，并在再次感染时发挥保护作用[32]。感染消退后，LLPCs主要存在骨髓中，持续分泌高亲和抗体，且抗体是针对初次感染时病毒E蛋白的免疫显性表位。然而，MBCs不仅可识别免疫显性表位，还可识别突变的免疫表位。因此，WNV突变株可能会逃逸高亲和力的LLPCs抗体的识别，而MBCs产生的抗体则可能会对突变株有中和作用。近期研究表明，将已免疫日本乙型脑炎病毒小鼠的MBCs被动转移至未免疫小鼠体内，可保护后者抵抗致死性WNV的攻击[33]，证明在黄病毒感染时，MBCs可提供交叉保护作用。缺失TLR3的小鼠免疫WNV时，MBCs的产生未受影响，但对生发中心和LLPCs有负面影响[26]。

2.1.2 针对WNV特异性表位的免疫应答 WNV的E蛋白含有中和抗体的主要识别位点。已知的抗体表位有3段：结构域Ⅰ－结构域Ⅲ（domainⅠ－domain III,DⅠ－DⅢ）。其中，不连续的DⅢ表位可刺激机体产生有效的中和抗体[34]。E16是一种被广泛研究的DⅢ－LR单克隆抗体，其在皮摩尔浓度下即具有中和WNV的能力[35]。除E蛋白外，也进行了针对WNV其他蛋白抗体的研究。有感染性的WNV粒子含有未裂解的prM，在小鼠和人的抗WNV免疫血清中，均可检测和分离到抗prM抗体[36]，但抗prM抗体在体内中和活性较差，保护能力较低[37]。体外实验证明抗NS1特异性抗体有保护活性[38]，推测NS1抗体可与被感染细胞表面表达的NS1结合，通过与巨噬细胞表达的Fc－γ受体作用，导致感染细胞被吞噬[39]，因此可考虑使用针对NS1的单克隆抗体作为预防药物。此外，也存在针对NS3、NS5[40]和衣壳蛋白[41]的抗体反应，但在保护机体对抗病毒感染过程中担任的角色尚不明确。

2.2 细胞免疫反应 单独被动转移抗体入重组激活基因（recombination activating gene,RAG）缺陷小鼠（缺失B和T淋巴细胞）体内，不能充分保护小鼠，只能延迟死亡；胸腺输出的初始T淋巴细胞如果减少，会导致初次应对WNV感染时反应能力下降[42]。研究表明，T淋巴细胞介导的细胞免疫在病毒清除中也具有重要作用[30]。

WNV感染CD4+T淋巴细胞缺陷的小鼠后，病毒在其CNS内存留的时间延长，导致小鼠在感染后50 d死亡[43]。感染后15 d，缺陷小鼠体内WNV特异性IgM水平是正常小鼠的1/20，IgG水平是正常小鼠的1/1000～1/100，且特异性CD8+T淋巴细胞的活化和进入CNS内的数量明显下降[43]。因此，在首次感染WNV时，CD4+T淋巴细胞的作用是辅助抗体反应并维持特异性CD8+T淋巴细胞反应，以有利于CNS内病毒的清除。

CD8+T淋巴细胞在控制WNV感染中有直接作用[44]。缺失CD8+T淋巴细胞或经典的Ia型主要组织相容性复合物抗原的小鼠感染致病性WNV时，CNS内可检测到高滴度病毒，且死亡率增加[45]。值得一提的是，缺失CD8+T淋巴细胞的小鼠首次感染WNV时，抗体产生数量正常，病毒血症的动力学和程度也无影响，但存活小鼠的CNS内仍有病毒存在，且可持续数周。尽管抗体数量正常，且已证明IgM和IgG在阻止WNV进入CNS过程中有重要作用[29]，但WNV仍可进入大脑，说明CD8+T淋巴细胞在免疫清除病毒过程中有重要功能。

3 小 结

WNV病广泛流行于世界多个地区，对公共卫生安全有极大威胁[46]，因此开展WNV病的预防和治疗研究意义重大。为此，须首先阐明机体对抗病毒产生的免疫反应机制。现已有许多关于WNV感染时机体免疫应答的研究，但仍有许多问题有待解决[34]，例如：病毒蛋白、RNA元件和非编码RNA在调节固有免疫反应中的作用；病毒被免疫系统识别或逃逸免疫系统监视的机制；IgG在初次感染病毒时起的作用；抗prM抗体在感染中的作用；早期活化B淋巴细胞的信号有哪些；WNV进入CNS的机制等。此外，大部分研究是以小鼠为模型建立的，在鸟类体内的免疫反应同哺乳动物体内是否相同，以及免疫反应如何影响疾病的发展尚不明确。也有证据表明，不同种类鸟体内免疫反应的不同会影响WNV感染的结果[47]。总之，WNV感染后机体的免疫反应是多因素共同作用的结果，深入了解其中的各个环节有利于加深我们对免疫反应的理解，也可为如何提高免疫反应、研制新型疫苗奠定基础。

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