补体C5基因多态性与维吾尔族饲鸽者肺易患性的关系研究

彭 玲，邬 超，杨晓红



补体C5基因多态性与维吾尔族饲鸽者肺易患性的关系研究

彭 玲，邬 超，杨晓红

目的 探讨补体C5基因多态性与维吾尔族饲鸽者肺(PBL)易患性的关系。方法 选取2012年1月—2013年12月在喀什、和田地区饲养鸽子年限≥1年并在新疆维吾尔自治区人民医院呼吸科病房和门诊确诊的维吾尔族PBL患者为病例组(n=32)，选择饲养鸽子年限≥1年的维吾尔族未患PBL者为阴性对照组(n=30)，选择同期未饲养鸽子且本院体检健康的维吾尔族人群为正常对照组(n=30)。抽取受试者外周血抗凝，提取白细胞DNA，采用MassARRAY Assay Design实时PCR 法进行C5基因14个单核苷酸多态性(SNP)位点检测，对存在等位基因的SNP位点进行组间比较。结果 C5基因rs17611、rs17612、rs17216529存在基因多态性，其中rs17611、rs17216529位点存在GG、AA、GA 3种基因型，rs17612位点存在CC、AA、CA 3种基因型。3组C5基因rs17611、rs17216529、rs17612基因型及等位基因频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 补体C5 基因多态性可能不影响维吾尔族PBL的发病风险。

养鸟者肺；肺泡炎,外源性变应性；补体C5；多态性,单核苷酸；疾病遗传易感性；维吾尔族

彭玲，邬超，杨晓红.补体C5基因多态性与维吾尔族饲鸽者肺易患性的关系研究[J].中国全科医学，2015，18(14)：1667-1671.[www.chinagp.net]

Peng L,Wu C,Yang XH.Relationship between C5 gene polymorphism and susceptibility to pigeon breeder′s lung in Uygur people[J].Chinese General Practice，2015，18(14)：1667-1671.

过敏性肺炎(HP)又名外源性过敏性肺泡炎，是一组易感宿主反复吸入环境中的细小悬浮有机物抗原诱发的以细胞免疫和体液免疫为主要反应介导的肉芽肿性炎性肺疾病[1]。饲鸽者肺(PBL)为HP的常见类型，是易感个体反复暴露于抗原后促发免疫反应导致的炎性肺泡炎。据报道，暴露人群中只有0.5%～7.5%会发展成为PBL[2]。前期研究发现，PBL的发病与Th1细胞和Th2细胞的失衡密切相关[3]，敏感个体暴露于抗原后，Th1细胞因子分泌的促炎因子与Th2细胞因子分泌的抗炎因子的分布可能影响PBL的易患性[4]。补体系统是机体重要的免疫防御系统，C5是补体系统中关键片段，是Th1/Th2失衡中的重要调节分子，其水平变化可能影响疾病的发生发展。C5基因多态性被证实与多种Th1/Th2失衡性疾病的易患性相关[5-7]。PBL是一种典型的Th1/Th2失衡性疾病，晚期发展成为不可逆性的肺纤维化，C5基因多态性与PBL发病的易患性尚未见报道。本研究探讨了C5基因多态性与维吾尔族PBL发病的关系，以期从分子水平阐释PBL的发病机制。

1 对象与方法

1.2 选择位点 C5基因位于9号染色体上，本研究对C5基因的14个单核苷酸的多态性(SNP)位点(rs17611、rs17612、rs17216529、rs2230212、rs201100938、rs2230215、rs144332635、rs41311883、rs141560628、rs118181017、rs41311887、rs35791896、rs148353209、rs188716286)进行检测。

1.3 检测方法

1.3.1 试剂 人全血基因组DNA试剂盒购自德国Greiner公司；多重PCR及延伸引物由Sequenom公司提供的MassARRAY Assay Design 软件设计，北京博奥生物有限合成。

1.3.2 DNA提取和保存 受试者均在清晨空腹抽取2份静脉血各4 ml，以3.2%枸橼酸钠抗凝。按照全血基因组DNA试剂盒说明书快速提取DNA(见图1)，-80 ℃深低温保存。

图1 全血基因组DNA提取图

1.3.3 SNP检测 采用SequenomMassARRAY Assay Design软件进行引物设计,多重PCR技术对所选位点的基因序列进行扩增(反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s,56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环45次；72 ℃ 3 min；4 ℃保持)。将PCR反应板放置于PCR仪上，启动PCR反应，将扩增产物保存在-20 ℃备用。将上述扩增产物中加入虾碱性磷酸酶(SAP)纯化并加入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，通过单碱基延伸引物(见表1)序列实现SNP位点的扩增,操作步骤按Sequenom公司的操作指南进行。延伸完毕后，产物通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基因分型技术进行SNP分型。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验 C5基因rs17611、rs17612、rs17216529共3个位点存在基因多态性。3组间C5基因的3个SNP位点基因型分布经χ2检验，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(χ2=1.428、0.001、4.861，P>0.05)，表明研究群体具有代表性。

2.2 基因分型的检测 rs17611、rs17216529位点在新疆维吾尔族人群中存在GG、GA、AA 3种基因型，rs17612位点存在CC、CA、AA 3种基因型。

表1 PCR引物及单碱基延伸引物序列

2.3 C5基因rs17611位点基因型及等位基因分布 各组C5基因rs17611位点基因型及等位基因频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05,见表2)。

表2 各组C5基因rs17611位点基因型及等位基因频率比较

Table 2 Comparison of genetypes and allele frequency of C5 rs17611 among the 3 groups

组别例数基因型GG AG AA等位基因G A正常对照组301010103030阴性对照组3091473228病例组3251892836χ2值4.4451.180P值0.3490.554

2.4 C5基因rs17612位点基因型及等位基因分布 各组C5基因rs17612位点基因型及等位基因频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05,见表3)。

2.5 C5基因rs17216529位点基因型及等位基因分布 各组C5基因rs17216529位点基因型及等位基因频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05,见表4)。

表3 各组C5基因rs17612位点基因型及等位基因频率比较

Table 3 Comparison of genetypes and allele frequency of C5 rs17612 among the 3 groups

组别例数基因型GG AG AA等位基因G A正常对照组300228258阴性对照组300327357病例组320032064χ2值3.1443.056P值0.2080.217

表4 各组C5基因rs17216529位点基因型及等位基因频率比较

Table 4 Comparison of genetypes and allele frequency of C5 rs17216529 among the 3 groups

组别例数基因型GG AG AA等位基因G A正常对照组30201005010阴性对照组3021 9 051 9 病例组32221005410χ2值0.0790.064P值0.9610.968

3 讨论

机体Th1/Th2失衡参与多种变态反应性疾病、自身免疫性系统疾病和移植排斥反应等疾病的发生。PBL是一种复杂的多因子疾病，Th1/Th2失衡所分泌的相关免疫学因子促进其发生发展，但只有少部分人暴露抗原后会发展为PBL。Th1/Th2失衡相关基因多态性与PBL关系的相关研究显示，主要组织相容性复合体-Ⅱ(MHC-Ⅱ)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、抗原提呈蛋白-1(TAP-1)、金属蛋白酶组织抑制剂-3(TIMP-3)等基因SNP均被证实与PBL的遗传易患性相关[8-10]。

C5是补体系统的重要组成部分，其基因编码的蛋白在Th1/Th2失衡性疾病的炎性免疫应答中发挥了极其关键的作用。在PBL的发病机制中，鸽子粪便、羽毛等外源性抗原可直接激活补体旁路途径和巨噬细胞，引发补体介导的细胞毒性损害，从而造成肺组织炎症。早期研究发现，在农民肺的动物模型及患者的活检肺组织中均有补体沉着[1l]。C5基因是与炎症发生发展有关的免疫相关基因[12]，该基因的突变导致C5蛋白构象的稳定性降低，加速其降解，患者表现为严重复发性感染倾向。如前所述，C5基因多态性已明确证明与多种Th1/Th2失衡性疾病关联[13],提示在Th1/Th2失衡性疾病中可能存在共同基因或者共同的细胞途径。

本研究发现，C5基因rs17611、rs17612、rs17216529共3个位点存在变异。rs17611位点参与C5蛋白质第802号氨基酸序列的编码。多数情况下该位点的2个等位基因碱基均是G(即GG型)，转录翻译为缬氨酸；当2个碱基都转换为A时(即AA型)，转录翻译该位置时全部为异亮氨酸；当其中一个碱基转换为A时(即AG型)，转录翻译后该位置半数为异亮氨酸。国内学者研究发现该位点的突变增加了乙型肝炎病毒感染者发生肝硬化的风险[14],可能与C5的结构、功能和表达水平有关。也有报道表明rs17611位点突变增加微血管疾病发生的风险[15]。本研究发现，rs17611等位基因A和G及各基因型频率3组间无明显差异，提示其与PBL的易患性不相关，不是PBL的风险因素。而关于rs17612、rs17216529在其他疾病中的研究报道较少，本研究发现rs17612在此次研究中存在等位基因A和C以及AA、CA两种基因型，rs17216529存在等位基因A和G以及GG、GA两种基因型，结果表明这两个位点均未增加PBL的遗传风险。这可能与C5基因高度保守有一定关系，考虑到本研究样本量较小，因此有必要进一步进行大样本的重复研究来验证。

综上所述，本研究纳入的样本量较少，在一定程度上可能影响研究结果，仍需进一步扩大样本量，在不同民族间进行重复研究来证实和阐明PBL的遗传发病机制。从遗传学的角度讲，寻找与疾病发生风险相关的基因，一般先从SNP数据库入手，选择等位频率比较高的位点进行SNP分型。该方法虽简单易行，但是存在一定的盲目性，甚至可能得到阴性结果，存在一定的风险性。因此，有效地发掘与疾病关联SNP仍是今后研究面临的一大挑战。

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(本文编辑：吴立波)

Relationship Between C5 Gene Polymorphism and Susceptibility to Pigeon Breeder′s Lung in Uygur People

PENGLing,WUChao,YANGXiao-hong.

DepartmentofClinicalResearch，ShiheziUniversity,Shihezi832002,China

Objective To evaluate the association between C5 gene polymorphism and susceptibility to pigeon breeder′s lung (PBL) in Uygur people.Methods We enrolled 32 Uygur patients who had bred pigeons for more than one year，came from KashiRegon and Hetian，and were diagnosed with PBL in the outpatient clinic and the Department of Pneumology，the People′s Hospital of Xinjiang from January 2012 to December 2013 as the case group.30 Uygur who had bred pigeons for more than one year and weren′t diagnosed with PBL,were enrolled as negative control group.Another 30 healthy Uygur people who hadn′t bred pigeons and received physical examination in the hospital in the same period were enrolled as the normal control group.Peripheral blood was sampled from the subjects,and leucocyte DNA was extracted from the samples.We conducted tests on 14 single nucleotide polymorphism (SNP) loci in C5 genes by real-time polymerase chain reaction (PCR) method of MassARRAY Assay Design.The three groups were compared in the SNP loci with allelic genes.Results Gene polymorphism was found in the loci of rs17611,rs17612 and rs17216529.Genotypes of GG,AA and GA were found in rs17611 and rs17216529;genotypes of CC,AA and CA were found in rs17612.No significant differences were found in rs17611,rs17216529 and rs17612 in genotype and allele frequency among three groups(P>0.05).Conclusion C5 gene polymorphisms may not have on influence on the susceptibility to PBL in Uygur people.

Bird fancier′s lung；Alveolitis,extrinsic allergic；Complement C5；Polymorphism,single nucleotide；Genetic predisposition to disease；Uygur nationality

国家自然科学基金资助项目(81260003)

832002新疆石河子市，石河子大学医学院临床系(彭玲)；新疆维吾尔自治区人民医院呼吸与危重症医学科(邬超，杨晓红)

杨晓红，新疆维吾尔自治区人民医院呼吸与危重症医学科；E-mail：yxh6176@126.com

R 563.19

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.14.016

2014-11-10；

2015-03-03)