小鼠来源的OX40融合蛋白的表达鉴定及优化表达

杜雪梅，苏毅，王晓燕，赵蕾，鞠吉雨，唐华平，冯永堂(青岛市市立医院，山东青岛6607;潍坊医学院免疫学教研室)

小鼠来源的OX40融合蛋白的表达鉴定及优化表达

杜雪梅1，苏毅1，王晓燕1，赵蕾1，鞠吉雨2，唐华平1，冯永堂2
(1青岛市市立医院，山东青岛266071;2潍坊医学院免疫学教研室)

摘要:目的鉴定及优化表达小鼠来源的OX40融合蛋白。方法将已构建好的pET32a-OX40重组质粒DNA转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂于含Amp平板筛选出阳性克隆，经Western blotting鉴定融合蛋白，对阳性克隆株通过改变异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、培养温度及时间条件，观察目的融合蛋白表达的变化。结果转化的质粒经Western blotting鉴定，证实有目的蛋白表达。当温度、时间不变时，IPTG分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mmol/L，7个不同浓度实验结果以0.4mmol/L时蛋白表达量最高。当IPTG浓度、时间不变时，在20、25、30、35、40℃不同的温度点，以30℃时蛋白表达量最高。当温度、IPTG浓度不变时，1、2、3、4、5、6 h不同时间点，以4 h时蛋白表达量最高。结论小鼠来源的OX40融合蛋白在BL21细胞获得成功表达，并获得其最佳表达条件(IPTG浓度0.4mmol/L、温度30℃、诱导4 h)。

关键词:OX40融合蛋白; pET32a-OX40重组质粒DNA;大肠杆菌BL21;动物试验doi: 10.3969/j.issn.1002-266X.2015.35.008

机体的免疫应答过程中，T细胞活化除了需要MHC-抗原肽外，还需要其他一些共刺激分子的协同参与，其中OX40/OX40L是一对近年来备受重视的新型共刺激分子［1］。OX40介导的共刺激信号在T细胞初次和再次免疫应答中都发挥重要作用，可以促进CD+4T细胞的活化、增殖、迁移，延长其寿命，并促进生发中心的形成和细胞的分化成熟［2，3］。OX40主要表达在被抗原激活的特异性T细胞上，其生物学功能主要是强化和维持效应特异性T细胞对抗原的特异性免疫应答，OX40表达和生物学功能的特殊性使其成为一个理想的免疫干预靶点［1］。如果对OX40及其配体间的相互作用进行不同的干预措施，可能是提高或抑制免疫应答能力及治疗某些疾病的有效途径之一。本研究将已构建的小鼠来源的OX40原核表达载体转入大肠杆菌，对其表达的融合蛋白进行鉴定，并对影响诱导表达的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、温度及时间条件进行了优化探索，以便为该蛋白的批量表达、纯化及下一步单克隆抗体的制备提供最佳条件。

1　材料与方法

1.1主要试剂IPTG(Gibco公司);中分子量蛋白Marker(上海生化所);甘氨酸、二硫苏糖醇、考马斯亮蓝R-250、琼脂糖(西班牙产品分装)、Tween-20(Amresco分装)、Tris(Amresco分装)均购自上海生工生物工程公司;抗-His·tag单抗(Novagen公司);dAB显色试剂盒(北京天为时代公司)。HRP标记的兔抗小鼠IgG(Jackson公司);丙烯酰胺、N，N-亚甲叉双丙烯酰胺、过硫酸(Bio-Rad公司)。

1.2质粒及菌株DH5α由潍坊医学院免疫学教研室冻存，重组质粒pET32a-OX40(经鉴定无误)由潍坊医学院免疫学教研室构建并冻存。

1.3大肠杆菌BL21(DE3)感受态的制备及转化用CaCl2法制备大肠杆菌感受态，分装成200 μL的小份，贮存于－70℃下备用。取200 μL感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上，加入pET32a-OX40重组质粒DNA(含量不超过50 ng，体积不超过10 μL)，轻轻摇匀，冰上放置30min、42℃水浴中热击90 s后迅速置冰上冷却3～5min，向管中加入1mL LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养1 h，使细菌恢复正常生长状态取100 μL涂布于含抗生素的筛选平板上，正面向上放置，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16～24 h。

1.4小鼠来源的OX40融合蛋白的小量诱导表达及鉴定分别接种转化有pET32a-OX40重组质粒的单个菌落及相应的空白质粒对照单菌落pET32a(+)于5mL LB(Amp +)液体培养基中，37℃、160 r/min，振

荡培养过夜。次日以1∶100的比例转种于新鲜的LB(Amp +)液体培养基中，于37℃、220 r/min培养至OD600约为0.6后，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L(待定)，继续培养3 h(待定)。离心收集菌体:取1.5mL菌液于已灭菌的1.5mL Eppendorf管中，12 000 r/min离心5min后取菌体沉淀，沉淀加上样缓冲液水煮5min，与上清一同经SDS-PAGE电泳分析，然后进行Western blotting鉴定。

1.5融合蛋白大量诱导IPTG浓度的优化接种转化有pET32a-OX40重组质粒的单个菌落于5mL LB(Amp +)液体培养基中，37℃、160 r/min，振荡培养过夜。次日以1∶100的比例转种于新鲜的LB(Amp +)液体培养基中，于37℃、220 r/min培养至OD600约为0.6后，加入IPTG使终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mmol/L，37℃(待定)继续培养3 h(待定)，离心收集菌体:取1mL菌液于已灭菌的1.5mL Eppendorf管中，12 000 r/min离心5min后取菌体沉淀，SDS-PAGE电泳分析，其余的离心沉淀－70℃冻存备用。

1.6融合蛋白大量诱导温度条件的优化同上摇菌至OD600约为0.6后，加入IPTG至终浓度为0.3mmol/L，分别于20、25、30、35、40℃振荡培养3 h(待定)，同上收集菌体，SDS-PAGE电泳分析。

1.7融合蛋白大量诱导时间条件的优化同上摇菌至OD600约为0.6后，加入0.3mmol/L IPTG，于28℃分别振荡培养1、2、3、4、5、6 h，同上收集菌体，SDS-PAGE电泳分析。

1.8不同条件诱导表达融合蛋白的SDS-PAGE电泳上样样品处理取1.5mL细菌离心后的菌体沉淀以灭菌的PBS(pH7.4)洗涤3次，以100 μL PBS(pH7.4)重悬，超声破菌。超声条件:工作3 s、间歇3 s，连续99次，冰浴超声，超声结束，12 000 r/min离心30min，分别保留胞质上清和包涵体沉淀。胞质上清和培养基上清各加20 μL 1×SDS凝胶上样缓冲液混匀，沉淀加40 μL 1×SDS凝胶上样缓冲液混匀，和蛋白分子量标准一起于沸水浴中煮沸5min，12 000 r/min离心5min，取上清20 μL上样。

2　结果

2.1 pET32a-OX40重组质粒DNA的转化及融合蛋白的表达和鉴定pET32a-OX40重组质粒DNA转入大肠杆菌BL21后，在IPTG浓度为0.5mmol/L、温度37℃、诱导3 h条件下可获得OX40融合蛋白的表达。诱导后pET32a、诱导前pET32a、诱导后全菌体、胞质上清、诱导后包涵体、培养基上清分别经SDS-PAGE电泳分析显示:重组载体经诱导后在蛋白Marker的42.7～66.2 kD出现新的融合蛋白条带，融合蛋白主要存在于细胞内，未能分泌到细胞外，细胞内的融合蛋白主要存在于包涵体中，细胞质中未见到明显可溶性目的蛋白(图1)。包涵体经Western blotting鉴定，可以看到一明显的条带，表明融合蛋白可与抗-His·tag的一抗发生特异性结合，说明我们获得OX40胞外段融合蛋白的表达产物。SDS-PAGE电泳结果表明融合蛋白主要存在于细胞内的包涵体中。

图1　pET图32a-OX图40诱导表达及融合蛋白分布情况的SDS-PAGE电泳分析结果

2.2 IPTG浓度对小鼠OX40融合蛋白表达的影响

当温度、时间不变时，IPTG分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mmol/L，7个不同浓度实验结果以0.4mmol/L时蛋白表达量最高(图2)。

图2　不同IPTG浓度诱导的分析结果

2.3温度条件对小鼠OX40融合蛋白表达的影响当IPTG浓度、时间不变时，在20、25、30、35、40℃不同的温度点，以30℃时蛋白表达量最高(图3)。

2.4培养时间对小鼠OX40融合蛋白表达的影响当温度、IPTG浓度不变时，在1、2、3、4、5、6 h不同时间点，以4 h时融合蛋白的表达量最高(图4)。

图3　不同温度诱导的分析结果

图4　不同时间诱导的分析结果

3　讨论

在机体的免疫应答过程中，OX40/OX40L作为一对重要的共刺激分子，为T、B细胞的激活提供了重要的共刺激信号［4，5］。由于OX40/OX40L在机体的免疫应答和自身免疫性疾病的发生发展中发挥重要作用，并随着生物学功能的进一步揭示逐渐成为临床干预自身免疫性疾病、移植排斥反应和肿瘤的一个理想靶点［6～10］;通过对其干预所进行的免疫治疗在自身免疫病动物模型上已经取得可喜的效果［1，7，11］。

本试验利用该室自己构建的带有His·tag标签的pET32a-OX40重组质粒转入大肠杆菌BL21，经Western blotting检测融合蛋白可与抗-His·tag的一抗发生特异性的结合，说明获得了OX40融合蛋白表达产物。当然，对于融合标签的检测只是一个利于纯化的相对特异性标记，后续我们将以抗-OX40的抗体或OX40L对表达产物的特异性作进一步确认。由电泳图可见，融合蛋白主要存在于菌体超声破碎后的沉淀物即包涵体中，包涵体是变性的不溶性颗粒，其主要成分为表达产物，其次还有菌体膜蛋白、脂质、多糖核酸物质以及RNA聚合酶等杂质。以包涵体形式表达的重组蛋白生产具有以下优势［12］:①包涵体具有高密度且在水溶液通常不溶解，有利于表达产物的分离纯化。②重组蛋白以包涵体的形式表达，有效抵御了宿主菌蛋白酶对表达产物的降解。③对于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒害的蛋白时，包涵体的形成无疑是最佳选择。外源基因在大肠杆菌中的高效表达与培养条件密切相关，环境条件不仅对菌体的生长和代谢有影响，还会影响到宿主、表达载体和外源基因三者之间的关系，从而影响外源基因的高效表达。

为提高OX40融合蛋白在大肠杆菌中的表达量和包涵体的纯度，我们对培养时间、温度、IPTG浓度等条件进行优化，以求获得最大量的蛋白表达。一般认为高温(42℃)会促进包涵体的形成，但我们反复摸索的实验条件发现，30℃时OX40融合蛋白的表达量较高;加入不同浓度的IPTG，目的蛋白的表达量差别不是特别明显，当IPTG浓度为0.4mmol/L时表达量稍高;在诱导培养的不同时间取样观察发现，随着时间的延长，目的蛋白的表达量明显增加，4 h时达最高值，继续诱导，目的蛋白表达量反而降低。因此，我们选择的诱导参数是温度30℃、IPTG浓度0.4mmol/L、诱导时间4 h，在此条件下OX40融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的20%左右，获得了较理想的表达条件。

总之，小鼠来源的OX40融合蛋白的鉴定及高效表达条件的优化不仅为进一步批量获取和纯化目的蛋白提供了技术参数，而且也为制备OX40单克隆抗体以及进行相关的横向研究打下了良好的基础，这在未来的基础和临床研究中将有极好的开发应用前景。

参考文献:

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［4］Kaurd，Brightling C.OX40/OX40 ligand interactions in T-cell regulation and asthma［J］.Chest，2012，141(2): 494-499.

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通信作者:唐华平，冯永堂

文章编号:1002-266X(2015)35-0025-04

文献标志码:A

中图分类号:R378.2