高压氧对大鼠脊髓损伤的治疗作用及机制

刘士臣，申福国，杨建华，乔建民，季庆辉，崔宏宇，张富运(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯54003;齐齐哈尔医学院附属第三医院)

高压氧对大鼠脊髓损伤的治疗作用及机制

刘士臣1，申福国2，杨建华1，乔建民1，季庆辉1，崔宏宇1，张富运1
(1佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154003;2齐齐哈尔医学院附属第三医院)

摘要:目的观察高压氧(HBO)治疗对大鼠脊髓损伤(SCI)的治疗作用，并探讨其可能机制。方法25只健康清洁级成年SD大鼠随机分为SCI组10只、HBO组10只、对照组5只，SCI组、HBO组大鼠均制备SCI模型，HBO组制模成功后采用HBO治疗;对照组采取同前方法咬开椎板，不损伤脊髓，后给予缝合。观察两组大鼠不同时点(制模成功后6 h及1、3、7、14、21d，分别计为T1、T2、T3、T4、T5、T6)BBB评分及脊髓组织中突触素ⅠmRNA。结果与对照组比较，HBO组、SCI组各时点(T3、T4、T5、T6)BBB评分及脊髓组织突触素ⅠmRNA表达升高(P均＜0.05);与SCI组比较，HBO组各时点(T3、T4、T5、T6)BBB评分及脊髓组织突触素ⅠmRNA表达升高(P均＜0.05)。结论HBO可促进大鼠损伤脊髓的恢复，其机制可能与上调损伤脊髓组织内突触素ⅠmRNA表达有关。

关键词:脊髓损伤;高压氧;突触素Ⅰ

Therapeutic effect of hyperbaric oxygen on spinal cord injury in rats and itsmechanism

LIU Shi-chen1，SHEN Fu-guo，YANG Jian-hua，QIAO Jian-min，JI Qing-hui，CUI Hong-yu，ZHANG Fu-yun
(1 The First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154003，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the therapeutic effect of hyperbaric oxygen(HBO)on the spinal cord injury(SCI)，and to explore its possiblemechanism.Methods Twenty-five healthy and clean SD adult rats were randomlydivided into the SCI group(n =10)，HBO group(n =10)and the control group(n =5).The SCImodel rats were prepared in the SCI and HBO groups，after the success ofmolding，the HBO group received HBO treatment; the vertebral plates of rats in the control group were opened and sutured withoutdamage to the spinal cord.BBB rating and synaptophysinⅠmRNA in the spinal cord tissues atdifferent time points(6 h aftermolding and 1，3，7，14 and 21d，which is counted as T1，T2，T3，T4，T5and T6)were observed in the two groups.Results Compared with the control group，the BBB rating and synaptophysinⅠmRNA expression was increased in the HBO group and SCI group at each time point(T3，T4，T5and T6)(all P＜0.05).Compared with the SCI group，the BBB rating and synaptophysinⅠmRNA expression was increased in the HBO group at each time point(T3，T4，T5and T6)(all P＜0.05).ConclusionHBO promoted the recovery of the injured spinal cord of rats，whichmay be related with the up-regulation of synaptophysinⅠmRNA expression in the injured spinal cord tissues.

Key words:spinal cord injury; hyperbaric oxygen; synaptophysin Ⅰ

脊髓损伤(SCI)是中枢系统最严重的损伤之一，因其致残率高，给社会和家庭带来沉重负担［1］。由于神经元不可再生，损伤后很难恢复，至今临床治疗仍未取得突破性进展。临床上，高压氧(HBO)治疗已在SCI患者中得到应用，但其具体治疗机制尚不明确［2］。突触素Ⅰ是主要存在于突触前膜上的一种膜蛋白，它在神经元间递质释放发挥了非常重要的作用，它的表达与突触的再生、延伸与其功能的恢复有关［3，4］。2014年11月～2015年1月，我们观察了HBO治疗对SCI大鼠神经功能恢复的影响，并

探讨其可能机制。

1　材料与方法

1.1主要试剂和仪器主要试剂:mRNA提取试剂盒、PCR反应试剂盒(大连宝生生物公司)，引物(上海鼎安生物科技有限公司);主要仪器:仿Allen's致伤装置(自行设计加工)，PCR扩增仪(美国PE公司)，全自动凝胶成像处理系统(Applied Biosystems公司)，NGT50B型高压氧舱(烟台冰轮锅炉有限公司)，凝胶成像系统(美国BioRad公司)，图像分析仪(日本Olympus公司)。

1.2实验动物及分组取健康清洁级成年SD大鼠25只，雌雄不限，体质量(300±50)g，均由佳木斯大学动物实验中心提供和饲养，实验过程中对动物的处理符合科学技术部颁布的《关于善待动物的指导性意见》。所有实验大鼠编号后按照随机数字表分为SCI组10只、HBO组10只、对照组5只。

1.3急性SCI模型制备及HBO治疗参照文献［5］方法复制大鼠急性SCI模型。取SCI组和HBO组大鼠称重，仰卧后以10%水合氯醛(0.3mL/100 g)腹腔注射麻醉，手术操作区除毛备皮、消毒、铺巾，按照T9为中心上下做纵行正中切口约3 cm，依次切开分离使棘突完全显露，去除棘突和椎板，完全暴露硬膜囊，取约3 cm2大小的垫片置于脊髓表面，用重10 g锤从10 cm高的瞄准器上垂直打击垫片，见脊髓组织出现肿胀、出血，大鼠出现摆尾反射，双下肢及躯体回缩扑动后自然松弛，双后肢迟缓性瘫痪，表明撞击成功，急性SCI模型造模成功。HBO组大鼠在造模后带笼放于动物高压舱内进行HBO治疗，1 次/d，每次60min，共治疗21d，具体方法按照参考文献［6］进行。使用前用纯氧洗舱20min，使舱内氧气体积分数度超过95%，置入实验大鼠后逐渐升压至0.25mPa，历时15min，稳压30min后逐渐减压至标准大气压，历时15min。对照组采取同前方法咬开椎板后不损伤脊髓，后给予缝合。

1.4运动功能评价采用BBB运动功能评分方法［7］对实验大鼠后肢各关节活动、步态和协调功能、爪的精细动作进行观察评分。采用3人互盲独立观察评分，取3人平均值为实验结果以减少误差影响。

1.5脊髓组织突触素Ⅰ检测各组分别于制模成功后6 h及1、3、7、14、21d各处死2只(分别计为T1、T2、T3、T4、T5、T6)，打开胸腔暴露心脏，先后分别以生理盐水和4%多聚甲醛溶液给予心内持续灌注，直至流出液体清澈，灌注完成以T9为中心上下各1 cm切取脊髓组织，4℃冰箱保存备用。分别严格按照RNAiso Plus、RNA PCR试剂盒说明书提取总RNA;其次，取其浓度用紫外分光光度仪测量RNA含量;再次，按照RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，起始总RNA样品均取2 μg严格按照反应条件行RT-PCR反应。PCR反应条件: 95℃变性5min，94℃、30 s，55℃、40 s，72℃、30 s，循环36周期，72℃延伸7min。取上述PCR产物进行电泳，以β-actin作为内参照，结果以突触素ⅠmRNA(OD 值)/β-actin(OD值)表示。

1.6统计学方法采用SPSS21.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较采用单因素方差分析及q检验(Newman-kueuls法)。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠BBB评分比较结果见表1。

表1　各组大鼠BBB评分比较(分，)

表1　各组大鼠BBB评分比较(分，)

注:与对照组比较，aP＜0.05;与SCI组比较，bP＜0.05。

组别BBB 评分T1　T2　T3　T4　T5　T6 HBO组　0　0　4.42±0.01a　9.37±0.01ab　12.10±0.01ab　13.22±0.02aSCI组　0　0　3.23±0.02a　7.10±0.02a　9.07±0.02a　12.80±0.03a对照组　21.00±0.00　21.00±0.00　21.00±0.00　21.00±0.00　21.00±0.00　21.00±0.00

2.2各组大鼠脊髓组织突触素ⅠmRNA表达比较结果见表2。

表2　各组大鼠脊髓组织突触素ⅠmRNA表达比较()

表2　各组大鼠脊髓组织突触素ⅠmRNA表达比较()

注:与对照组比较，aP＜0.05;与SCI组比较，bP＜0.05。

组别突触素ⅠmRNA T1　T2　T3　T4　T5　T6 HBO组　0.06±0.01　0.05±0.02　0.45±0.01ab　1.67±0.02ab　1.61±0.03ab　1.21±0.04aSCI组　0.05±0.02　0.04±0.03　0.22±0.04a　1.06±0.01a　1.45±0.04a　1.03±0.03a对照组　0.04±0.01　0.04±0.01　0.04±0.01　0.04±0.01　0.04±0.01　0.04±0.01

3　讨论

SCI后轻者会出现一定的神经症状，重者会出现截瘫、甚至死亡，由于神经损伤后功能恢复较差，所以SCI的保护及再生仍是困扰医学工作者的难题

之一。虽然目前研究者对SCI的保护和治疗机制有一定的认知，但是对SCI后损伤神经元保护或再生仍未有突破性进展。有学者发现，SCI后首先会出现神经元细胞和少突胶质细胞坏死或凋亡，刺激星形胶质细胞增殖，导致局部形成胶质瘢痕，阻碍神经元之间信号传递［8］。同时最近研究［2，9］发现，促红细胞生成素对SCI有明显的保护作用。

HBO治疗疾病在临床已经运用近百年之久，早在1965年Maeda等人首先将HBO引入临床尝试性治疗SCI患者，当时取得了可喜的临床疗效，从此HBO引起了研究者的注意。研究初期学者们只是认为HBO主要提高患者血氧饱和度，提高组织摄氧及氧弥散。当今随着对HBO研究进一步的深入，还发现HBO不仅可以提高血氧分压和迅速改善组织的缺氧状态，同时还可改善增强细胞线粒体酶活性，促进细胞对损伤修复和维持细胞正常代谢［10］，还可提高机体细胞及微环境中氧自由基含量［11］。有学者研究［12，13］发现，高压氧可改善脊髓功能的恢复，但是目前对于HBO治疗SCI损伤神经元的保护作用机制仍在探寻中。

突触结构是神经元之间信息传递、交换的重要结构，其主要由突触前膜、突触间隙和突触后膜构成。突触素Ⅰ主要存在于突触前膜上的一种膜蛋白，它在神经元间递质释放发挥了非常重要的作用，它的表达与突触的再生、延伸与其功能的恢复有关［14］，被认为是很好的突触特异标记物和功能指标［15，16］。中枢神经系统中分化成熟神经元细胞的轴突生长、延伸和轴突再塑性均受到机体的抑制，当神经元细胞受到损伤或周围微环境发生改变时，损伤远端的突触则会出现变性、萎缩、溃变，导致大量突触功能丧失，从而使远端信号传递发生中断，因此损伤远端突触结构的重建或重塑成为神经功能恢复重要环节［17］，而突触前膜中特异性相关蛋白突触素Ⅰ的合成、分泌和运输也成为突触重建或再塑的至关重要的物质之一。

本研究显示，HBO组、SCI组各时点(T3、T4、T5、T6)BBB评分较对照组升高，HBO组各时点(T3、T4、T5、T6)BBB评分较SCI组升高，提示HBO可以保护或促进大鼠SCI神经功能恢复。本研究还发现，HBO组、SCI组各时点(T3、T4、T5、T6)脊髓组织突触素ⅠmRNA表达较对照组升高，HBO组各时点(T3、T4、T5、T6)脊髓组织突触素ⅠmRNA表达较SCI组升高。提示BHO治疗促进了大鼠神经功能的恢复，这可能是HBO改变了损伤脊髓组织中神经元细胞内或周围微环境的作用，与上调神经元内突触素ⅠmRNA表达有关。

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收稿日期:( 2015-04-27)

通信作者简介:杨建华(1969-)，男，硕士生导师，主任医师，教授，主要研究方向为关节骨科。E-mail: jianhua01@163.com

作者简介:第一刘士臣(1979-)，男，硕士，主治医师，主要研究方向为脊柱外科和关节骨科。E-mail: liushichen1999@126.com

基金项目:黑龙江省自然科学基金资助项目(D201160);黑龙江省教育基金资助项目(12511539);佳木斯大学研究生创新科技项目(LZR2014-022)。

文章编号:1002-266X(2015)35-0016-03

文献标志码:A

中图分类号:R363.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.35.005