沙棘籽中总黄酮的提取及纯化工艺研究

苏利荣,马绍英,李胜,周文政,张品南,唐斌

(1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州　730070；2.甘肃顺意生物科技有限公司，甘肃 张掖　734000)



沙棘籽中总黄酮的提取及纯化工艺研究

苏利荣1,马绍英1,李胜1,周文政2,张品南1,唐斌1

(1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州730070；2.甘肃顺意生物科技有限公司，甘肃 张掖734000)

摘要：以沙棘籽为材料,利用有机溶剂法，研究了乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间等单因素对沙棘籽总黄酮提取率的影响，再以D-100、D-500、D-700 3种大孔吸附树脂为材料，筛选适宜于黄酮纯化的树脂类型，并利用正交试验优化了沙棘籽中总黄酮的提取及纯化工艺.结果表明：提取最佳工艺参数为乙醇浓度70%，料液比1∶25(g∶mL)，温度60 ℃，提取时间4 h/次.该条件下总黄酮提取率可达4.23%；最佳纯化工艺为以6 mg/mL的沙棘籽粗提液上柱，流速为2 mL/min，用80%乙醇洗脱，流速1 mL/min，在树脂与洗脱液的比例为1∶3的条件下洗脱时可达到最佳纯化效果，采用该工艺可使类黄酮的纯度由0.5%提高到88.46%.

关键词：沙棘籽；总黄酮；大孔吸附树脂；提取；纯化

沙棘(Hippophaerhamnoids)是胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属(Hippophae)的一种野生浆果植物，又名醋柳、沙枣、黑刺，为落叶灌木或乔木[1].沙棘籽中含有丰富的营养物质和100多种生物活性物质，其中含油约7%～12%[2].国内外对沙棘籽的利用主要集中在沙棘籽油的提取，而提取沙棘籽油后的残渣大部分都被废弃，其中含有的类黄酮也未得到利用，造成资源浪费.现代医学研究表明，黄酮类物质具有抗心率失常、降低血清胆固醇、抗炎、抗氧化、抗辐射、增强免疫、缓解心绞痛发作和防治冠状动脉粥样硬化性心脏病等的作用[3-7].目前，有关沙棘黄酮的研究多集中在功能试验与提取工艺上，纯化工艺研究均未能达到较高的纯度，且难以进行产业化生产[8].因此，本文以相对安全的粮食酒精为提取剂，采用有机溶剂法提取沙棘籽总黄酮，而后用大孔吸附树脂进行分离和纯化[9]，在单因素试验的基础上通过正交试验对沙棘籽总黄酮提取及纯化条件进行优化，以期建立沙棘籽中类黄酮的提取与纯化工艺，为沙棘籽的深度开发利用提供技术参考.

1材料与方法

1.1试验材料

以甘肃张掖润鑫生物科技有限公司提供的当年收获的沙棘籽为试验材料.

1.2试验方法

1.2.1样品的预处理取干燥沙棘籽，40目粉碎后用5倍体积的石油醚(沸程60～90 ℃)浸泡1 h后，70 ℃回流1 h.抽滤，共重复3次，弃去滤渣，自然挥干后得脱脂沙棘籽粉末[10].称取脱脂沙棘籽粉末1 g，用乙醇水浴提取.在4 000 r/min，5 ℃条件下离心10 min，合并2次提取液，用70%乙醇定容至一定体积待测.

1.2.2总黄酮含量的检测精密称取芦丁标准品5 mg，定容至10 mL容量瓶中，配成浓度为0.5 mg/mL的标准溶液[11].分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL标准液于10 mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.4 mL，摇匀，放置10 min，再加10%硝酸铝0.4 mL，摇匀，放置10 min，再加10%氢氧化钠溶液4 mL，摇匀，用70%酒精定容至刻度线，放置15 min，以空白试剂为对照在510 nm波长处测定吸光值[12]，建立回归方程：

y浓度=A吸光度×x+b

样品含量测定[13]：移取0.2 mL沙棘籽提取液于10 mL容量瓶中，按上述方法进行测定，依据所得的回归方程计算提取液中总黄酮含量.

沙棘籽总黄酮提取率(%)=C(mg/mL)×稀释倍数×定容体积

1.2.3沙棘籽黄酮的提取单因素试验设计分析沙棘籽黄酮提取工艺的各影响因素，以沙棘籽黄酮的提取率为主要判断依据，各因素水平设置如下：乙醇浓度为40%、50%、60%、70%、80%；料液比为1∶5、1∶15、1∶25、1∶35(g∶mL)；提取温度为40、50、60、70、80 ℃；提取时间为1、2、3、4 h，其它条件(以下4个水平中除考查因素外的另3个)设置为乙醇浓度60%、料液比1∶25(g∶mL)、提取温度60 ℃、提取时间2h，提取2次.

1.2.4黄酮提取正交试验设计根据单因素试验结果，选取乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间4个因素，以沙棘籽总黄酮提取率为试验指标，设计L9(34)正交试验.

1.2.5沙棘黄酮的纯化单因素试验设计

1.2.5.1提取液的预处理将提取液经减压蒸馏浓缩后蒸干制成粉末，用95%乙醇配成各浓度粗提液待用.

1.2.5.2树脂的预处理将型号为D-100、D-500、D-700的树脂用95%乙醇浸泡24 h，用蒸馏水漂洗至无白色浑浊液后，分别用浓度为4%的HCl和NaOH浸泡3 h，用蒸馏水漂洗至中性.

1.2.5.3树脂型号的选择试验称取处理好的各型号树脂1 g，分别置于100 mL锥形瓶中，精确加入4 mg/mL粗提液50 mL，震荡3 h后，取上清液测定吸光值.倒出上清液，分别加入70%乙醇50 mL进行解析，震荡3 h后，吸取上清液测定吸光值.

1.2.5.4料液浓度对大孔吸附树脂吸附效果影响称取10份1 g经处理的树脂，分别置于100 mL锥形瓶，加入浓度为0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5mg/mL的粗提液各50 mL，震荡3 h后，倒去上清液，各加入70%乙醇50 mL进行解析，震荡3 h后，吸取上清液测定吸光值.

1.2.5.5洗脱剂乙醇浓度的测定称取5份1 g经处理的树脂，分别置于100 mL锥形瓶中，各加入50 mL浓度为8 mg/mL粗提液，震荡3 h后倒去上层液，分别加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇进行解析，震荡3 h，吸取上清液测定吸光值.

1.2.5.6吸附流速对大孔吸附树脂吸附效果影响将称取好的3份40 g处理后的树脂，分别装入层析柱中，在流速为1、2、3、4 mL/min下过柱，直至树脂吸附饱和.用80%乙醇在流速为1 mL/min进行解析，收集解析液，待解析完毕后测定吸光值.

1.2.5.7动态吸附透过试验称取30 g处理后的树脂装入层析柱中，用浓度为8 mg/mL粗提液，在流速为2 mL/min下过柱.每20 mL收集1次流出液，测定吸光值.

1.2.5.8动态洗脱试验称取30 g吸附饱和的树脂装入层析柱中，用80%乙醇在流速为1 mL/min下进行洗脱，每10 mL收集1次流出液，测定吸光值.

1.2.6黄酮纯化正交试验设计根据单因素试验，选取乙醇浓度、料液浓度、吸附流速为试验因素，以总黄酮提取率为试验值设计三因素三水平的正交试验.

2结果与分析

2.1芦丁标准曲线的绘制

以吸光值A为横坐标，标准品浓度C为纵坐标作线性回归分析可得方程：

C= 0.099 5A-0.000 3(R2=0.999 3)

2.2提取工艺的单因素试验及优化结果与分析

2.2.1乙醇浓度和料液比对总黄酮提取率的影响从图1可看出，随乙醇浓度上升总黄酮提取率不断增加，达到60%时总黄酮的提取率最高；乙醇浓度再增加，总黄酮提取率下降；可能因为沙棘总黄酮与60%乙醇的极性较为接近，此浓度下的溶解度最大.故选择60%乙醇作为最佳提取剂浓度.

从图2中可看出，料液比在1∶25(g/mL)时提取率最高，当料液比提高到1∶35(g∶mL)时提取率无明显增加，故最佳料液比为1∶25(g∶mL).原因可能是在一定料液比条件下总黄酮的浸出速率达到平衡状态，若再增加溶剂量只能增加提取成本.

图1　乙醇浓度对总黄酮得率的影响

图2　料液比对总黄酮得率的影响

2.2.2提取温度和时间对总黄酮得率的影响由图3可以看出总黄酮提取率随着温度的升高先升高后下降，然而， 60 ℃条件下的提取率比50 ℃和70 ℃条件下的提取率变化显著，故选择60 ℃为最佳提取温度.

图3　提取温度对总黄酮得率的影响

从图4可以看出，随着提取时间的增加黄酮提取率不断升高，提取时间由3 h增加至4 h时，提取率变化不明显，原因为提取3 h后黄酮已提取充分，再增加提取时间，黄酮含量不再大幅度变化.因而在单因素水平选择3 h为最佳提取时间.

2.2.3正交试验结果正交试验水平如表1，结果如表2.由表2可知，沙棘籽总黄酮最佳提取工艺为A3B2C2D3，即沙棘籽总黄酮的最佳提取工艺条件为：以70%乙醇做提取剂，按料液比1∶25(g∶mL)，在60 ℃条件下每次提取4 h，共提取2次.根据以上最佳条件，进行验证性试验，在乙醇浓度为70%，料液比为1∶25(g∶mL)，提取温度为60 ℃，提取时间为4 h/次，共提取2次，重复3次，实际测得提取率为4.23%(脱脂沙棘籽干粉)，表明该最佳工艺条件的优化较理想.

图4　提取时间对总黄酮得率的影响

编号因素乙醇浓度/%料液比/(g∶mL)提取温度/℃提取时间/h1501∶155022601∶256033701∶35704

表2　正交试验结果

2.3类黄酮纯化单因素试验结果与分析

2.3.1树脂型号的确定由图5可见，在相同条件下型号为D-100的树脂吸附能力强于其他2种型号，且在较短时间内该树脂的解析能力也强于其他2种树脂.综合吸附能力和解析能力的结果，确定D-100型树脂为类黄酮纯化最佳树脂.

图5　树脂静态吸附解析能力比较

2.3.2料液浓度对吸附效果的影响由图6可以看出，当料液浓度小于8.5 mg/mL时，黄酮含量随料液浓度的增加而增加，当料液浓度超过8.5 mg/mL时，黄酮含量下降，可能与料液浓度过高时，粘度过大，影响吸附有关.然而，当料液浓度达到8.5 mg/mL时，黄酮含量变化不显著.因此，料液浓度为7.5 mg/mL时达到树脂的最佳吸附效果.

图6　料液浓度对吸附效果的影响曲线

2.3.3洗脱剂乙醇浓度和吸附流速的确定由图7可见，洗脱剂乙醇浓度低时，洗脱的效果较差，随着乙醇浓度逐渐增加，洗脱能力增强，当乙醇浓度达到80%后，洗脱效果几乎不变，考虑到成本，确定试验最佳洗脱剂乙醇最佳浓度为80%.

由图8可见，吸附流速主要是影响溶质向树脂表面扩散而决定吸附效果，由吸附流速对吸附效果影响曲线可以看出，在1 mL/min和2 mL/min的流速下，大孔吸附树脂的吸附效果最好，随着流速的增大吸附效果逐渐下降，可能由于流速过大，树脂尚未及时吸附黄酮类物质，黄酮就随上样液流出.由于1 mL/min流速过慢，上样耗时过长，故选择最佳流速为2 mL/min.

图7　乙醇浓度对吸附效果的影响

图8　吸附流速对吸附效果影响

2.3.4动态吸附透过试验由图9可见，当上样液量少时，吸附完全，上样液达到240 mL时，开始有流失，当上样液达到400 mL后，达到吸附平衡，随上样液量增加吸光值不再增加，达到吸附平衡，所以确定树脂与该浓度的料液比值为1∶13(g∶mL)时达到吸附饱和.

图9　动态吸附透过曲线

2.3.5动态洗脱试验由图10可见，当洗脱液量低于30 mL时，黄酮含量极低，说明解析很少.当洗脱液量达到30 mL时，黄酮开始解析且在洗脱液为70 mL时达到最大，而后开始下降.当洗脱液超过80 mL后黄酮含量很低，说明解析完全.所以，树脂与洗脱液在1∶3(g∶mL)时解析完全，达到最佳洗脱效果.

图10　动态洗脱曲线

2.3.6正交试验结果正交试验各因素与水平如表3，结果如表4.由表4中R值可知，各因素对试验的影响程度大小依次为：料液浓度>乙醇浓度>流速.所以综合考虑最佳纯化条件为：A2B1C2，即乙醇浓度80%，料液浓度6 mg/mL，流速2 mL/min，该条件下黄酮的纯度为88.46%，提高了177倍.

表3　正交试验因素与水平

表4　正交试验结果

以D-100大孔吸附树脂进行沙棘籽总黄酮的纯化，以6 mg/mL的料液浓度、2 mL/min的流速进行上柱，后以80%的乙醇进行洗脱，在流速为1 mL/min、树脂与洗脱液比例为1∶3(g∶mL)的条件下进行验证性试验，最终黄酮的纯度由粗产品的0.5%提高到88.34%，说明该纯化的工艺优化较为理想.

3结论

正交试验结果表明，沙棘籽总黄酮的最佳提取条件为：乙醇浓度70%、料液比1∶25、提取温度60 ℃、提取时间4 h/次，提取2次.在此条件下，总黄酮提取率可达4.07%.沙棘籽黄酮的最佳纯化条件为：6 mg/mL的料液浓度、2 mL/min的流速上柱，80%的乙醇洗脱，流速1 mL/min，树脂与洗脱液比例为1∶3(g∶mL)，在该条件下进行纯化，黄酮纯度可达88.46%.

参考文献

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(责任编辑李辛)

Study on the extraction and purification of flavones

from sea buckthorn seeds

SU Li-rong1,MA Shao-ying1,LI Sheng1,ZHOU Wen-zheng2,ZHANG Pin-nan1,TANG Bin1

(1.College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;

2.Gansu Shunyi Bio-Technology Co.Ltd,Zhangye 734000,China)

Abstract：Using sea buckthorn seeds as material,the extraction and purification process of total flavonoids in sea buckthorn seeds were studied.Organic solvent method was used to study the effects of alcohol concentration,ratio of solid to liquid,extraction temperature,and extraction time on the extraction ratio of total flavones.Then taking D-100,D-500 and D-700 macroporous adsorption resins as materials,the suitable type of resin for purification of flavonoids was chosen out.Results showed that the parameters of extraction process were as follow:ethanol concentration 70%,ratio of solid to liquid 1∶25(g∶mL),temperature 60 ℃ and extraction time 4 h.Under this condition the extraction ratio of the total flavones was 4.23%.The purification process was:the 6 mg/mL column on sea buckthorn seeds crude extracts,flow rate of 2 mL/min,with 80% alcohol as the eluent,peaking 1 mL/min,under the condition of solid-liquid ratio of 1∶3,eluting efficiency could achieved the best purification effects,using this technology,the purity of flavonoids in the crude product increased from 0.5% to 88.46%.

Key words：sea buckthorn seed;flavonoids;macroporous resin;extraction;purification

收稿日期：2014-04-08；修回日期：2014-04-16

通信作者：马绍英，女，实验师，主要从事作物生态生理研究.E-mail:mashy@gsau.edu.cn

中图分类号：S 793.6

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)01-0165-06

第一作者：苏利荣(1989-)，女，硕士研究生，主要从事植物组织培养和植物次生代谢物的提取与分离研究.E-mail:18894316403@163.com