甘肃省中部沿黄灌区马铃薯茎溃疡病病原菌生物学特性研究

路小琴，李亚娟，张文明，邱慧珍，张春红，朱静，

王蒂4，沈其荣5

(1.甘肃农业大学资源与环境学院，甘肃 兰州　730070；2.甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州　730070；

3. 甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州　730070；4.甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，

甘肃 兰州　730070；5.南京农业大学资源与环境学院，江苏 南京　210095)



甘肃省中部沿黄灌区马铃薯茎溃疡病病原菌生物学特性研究

路小琴1,2，李亚娟3，张文明1，2，邱慧珍1，2，张春红1，2，朱静1，2，

王蒂4，沈其荣5

(1.甘肃农业大学资源与环境学院，甘肃 兰州730070；2.甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州730070；

3. 甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州730070；4.甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，

甘肃 兰州730070；5.南京农业大学资源与环境学院，江苏 南京210095)

摘要：采用常规组织分离法从马铃薯茎溃疡病新鲜病株上分离病原菌，通过形态学鉴定和致病性测定，确定引起甘肃中部沿黄灌区马铃薯茎溃疡病的病原菌是丝核菌属的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani).通过固体和液体培养方法研究了马铃薯立枯丝核菌的生物学特性，以明确碳氮营养、温度和pH值等培养条件对病原菌的菌落生长和菌丝干质量的影响.结果表明：在固体培养基上，菌落生长的最佳碳源为可溶性淀粉和蔗糖，最佳氮源为硝酸钾和蛋白胨，pH为6～7.在液体培养基上，最佳碳源为可溶性淀粉，最佳氮源为硝酸钾，pH为7，最佳振荡频率为80 r/min.菌丝生长的最适温度在固体和液体培养基上均为25 ℃.

关键词：马铃薯茎溃疡病；立枯丝核菌；生物学特性

Biological characteristics of the pathogen causing potato

stem canker disease in Yellow River irrigation

甘肃省中部沿黄灌区是西北地区乃至全国重要的加工型马铃薯生产基地，地处该区的景泰条山农场的马铃薯生产以订单种植为主.旺盛的订单需求和有限的耕地资源使马铃薯连作障碍日益严重，茎溃疡等土传病害加剧[1-2].马铃薯连作不仅使立枯丝核菌过渡为根际土壤的优势种[3],而且随连作年限的增加，马铃薯根际土壤中立枯丝核菌的数量累积，块茎产量随之降低，由连作引起的立枯丝核菌在根际的积累是马铃薯产量降低的主要原因之一[4].

马铃薯茎溃疡病又称立枯病或黑痣病，病原菌是立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)，主要为害幼芽、茎基部及块茎，出苗前和苗期发病可导致出苗率低和幼苗死亡，侵染块茎可在其表皮上形成黑色或暗褐色的斑块，即黑痣病菌核，严重影响马铃薯块茎产量及商品价值[5-6].2010～2011年甘肃省中部主产区和干旱灌区马铃薯种植区因茎溃疡病引起的植株幼苗死亡率高达60%[4].中国马铃薯主产区内蒙古[7-9]、黑龙江和辽宁等省[10]对马铃薯黑痣病已有报道.内蒙古发病严重地块的植株死亡率高达70%～80%，块茎发病率达到100%[11].由此可见，茎溃疡病已成为影响中国马铃薯主产区产业健康发展的主要限制因素.然而，有关病原菌立枯丝核菌的生物学特性、侵染规律和融合群等研究仅有零星报道，且只通过菌落培养方式描述了生物学特性,而这一方法较难客观的反映病原菌对营养的需求状况[11-13].此外，本课题组正在进行的研究发现，引起马铃薯茎溃疡病的病原菌立枯丝核菌的融合群比较复杂，结果与已有的报道不同[14].为此，本研究采用常规组织分离法从马铃薯茎溃疡病病株发病部位分离病原菌，经形态学、致病性测定和分子鉴定确定该病原菌，同时采用固体和液体两种菌丝体培养方式，从碳氮源营养、温度及pH值等方面对立枯丝核菌的生物学特性进行系统研究，旨在探明立枯丝核菌的生长发育与环境条件之间的关系，为进一步研究立枯丝核菌的侵染规律、融合群的鉴定和筛选高效拮抗菌，为马铃薯茎溃疡病的生物防治提供理论依据.

1材料与方法

1.1材料

2011年从甘肃省景泰条山农场连作马铃薯地块中采集具有典型马铃薯茎溃疡病症状的病株,带回实验室.

1.2方法

1.2.1病原菌的分离、培养和纯化采用常规组织分离法从马铃薯茎溃疡病的病株发病部位分离病原菌，用WA培养基进行组织分离，PSA培养基纯化，进行致病性测定和生物学特性试验.

1.2.2病原菌鉴定致病性测定：采用土壤接种法[15]进行回接试验，测定其致病性.将培养3 d的病原菌接种于1∶4的玉米、砂子培养基上，1周后按2%的接菌量与灭菌的土混合均匀，分装于育苗钵内，然后再将用KMnO4消毒10 min的马铃薯种子分别播种于花盆中，每盆2株，共10盆，置于25 ℃温室中培养，以不接菌做对照，于不同时期采样观察病症情况.

形态学鉴定：在PSA培养基上，25 ℃培养3 d后，显微镜下观察菌丝体形态特征并拍照，同时结合菌落颜色、生长速度进行形态学鉴定[16-17].

1.3立枯丝核菌生物学特性研究

1.3.1碳源对菌丝生长和菌丝干质量的影响分别以等质量的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、可溶性淀粉替代查氏培养基中的碳源，设无碳源培养基为对照[18-19].将直径6 mm的菌饼接种于固体培养基上，25 ℃培养每隔24 h采用“十”字交叉法测量菌落直径，并观察菌落生长情况；在100 mL灭菌的培养液中接入5个直径为6 mm的菌饼，80 r/min振荡培养一周.过滤后将菌丝和已烘干称质量的滤纸放入80 ℃干燥箱处理2 h，每处理5次重复，称质量并计算菌丝干质量.

1.3.2氮源对菌丝生长和菌丝干质量的影响分别以等质量的硝酸钾、硝酸钠、硝酸铵、尿素、硫酸铵、氯化铵、蛋白胨、L-蛋氨酸分别替代查氏培养其中的氮源，设无氮培养基为对照.其他同1.3.1.

1.3.3pH值对菌丝生长和菌丝干质量的影响 设8个pH梯度：4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0,采用的PSA培养基,无菌条件下配制成不同pH值的培养基.pH值用Mettler Toledo pH计测定.其他同1.3.1.

1.3.4温度对菌丝生长和菌丝干质量的影响设8个温度梯度：0，5，10，15，20，25，30，35 ℃,采用PSA培养基.其他同1.3.1.

1.3.5通气状况对菌丝干质量的影响设5个处理：0，40，80，120，160 r/min，采用查氏培养液接菌后置于振荡培养箱中培养.其他同1.3.1.

2结果与分析

2.1马铃薯茎溃疡病病原菌鉴定

2.1.1致病性测定结果病原菌回接后马铃薯植株表现如下症状：植株矮小，下部叶片发黄，茎基部形成褐色凹陷斑.收获的薯块表皮上形成黑色或暗褐色的斑块，用水冲洗不掉，病斑下面的组织完好无损(图1).植株发病症状与田间自然发病症状完全一致(图2).根据柯赫氏法则，从病斑处再次分离的菌株与接种菌株的形态一致，证明该菌株是马铃薯茎溃疡病的致病菌株.

图1　对照和接种病原菌的块茎

图2　田间发病和回接发病症状

2.1.2病原菌形态鉴定25 ℃下在PSA培养基上培养3 d，菌落丝状直径为9 cm；菌核为白色，培养7 d后，菌核成熟呈黑褐色.单个分散或多个聚集产生于培养基表面或培养皿壁上，内外颜色一致，表面粗糙(图3).在显微镜下观察到的菌丝体初期无色，棉絮状或丝状，随后逐渐缩短变粗为浅褐色，老熟菌丝有明显分隔.菌丝分枝处多呈直角，分枝基部明显缢缩，不产生孢子(图4).根据形态学特征，确定分离到的病原菌为丝核菌属的立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani).

图3　病原菌在培养基上7 d产生的菌核

图4　病原菌的菌丝和分枝

2.2不同生长因素对立枯丝核菌菌丝生长的影响

2.2.1碳源对菌丝生长和菌丝干质量的影响图5结果显示，在固体培养基上，立枯丝核菌在所有供试碳源培养基上均能生长，但是在可溶性淀粉和蔗糖培养基上生长较快，表现为菌落生长健壮、菌丝浓密.葡萄糖和麦芽糖处理的菌落直径显著小于对照.

在液体培养基中，与对照相比，所有供试碳源均能增加菌丝体干质量，但以可溶性淀粉和蔗糖的效果最好，菌丝体干质量分别为对照的8.94倍和6.98倍；甘露醇培养基的菌落直径与可溶性淀粉和蔗糖接近，但是菌丝干质量仅为二者的1/4和1/3，说明甘露醇处理在固体培养基上菌落生长快，但菌落比较稀疏.

2.2.2氮源对菌丝生长和菌丝干质量的影响图6结果显示，在固体培养基上，在以硝酸钾和蛋白胨为氮源时，立枯丝核菌菌丝生长最快，菌落直径显著大于其他氮源，试验发现培养2 d时菌落直径即为对照的1.51倍.所有处理中以尿素培养基上的菌丝生长最慢，菌落直径仅为对照的1/2，为硝酸钾处理的1/3，可能是尿素对立枯丝核菌生长有抑制作用.

C0：无碳；C1：蔗糖；C2：可溶性淀粉；C3：葡萄糖；C4：麦芽糖；C5：甘露醇；不同小写字母表示在0.05水平上差异显著.

图5碳源对菌落生长和菌丝干质量的影响

Fig.5Effect of various carbon sources colony growth

and dry mycelial weight ofR.solani

N0：无氮；N1：硫酸铵；N2：蛋白胨；N3：氯化铵；N4：尿素；N5：硝酸钠;N6：硝酸铵；N7：蛋氨酸；N8：硝酸钾；不同小写字母表示在0.05水平上差异显著.

图6氮源对菌落生长和菌丝干质量的影响

Fig.6Effect of various nitrogen sources on colony

and dry mycelial weight ofR.solani

在液体培养基中，菌丝体干质量也以硝酸钾处理最好，菌丝体干质量为对照的2.56倍.由此说明，立枯丝核菌在固体和液体培养基中以硝酸钾为氮源时有利于菌丝生长.

2.2.3pH值对菌丝生长和菌丝干质量的影响图7结果显示，在固体培养基中，立枯丝核菌在pH 4～11范围内均能生长.固体培养时，以pH为6～7时最有利于菌丝的生长(P<0.05).

但在液体培养pH7时菌丝生长最快，pH6时菌丝干质量明显低于pH7的菌丝干质量，升高或降低一个pH单位均会显著降低菌丝干质量，说明在液体培养条件下，立枯丝核菌的生长对pH变化的反应更加敏感.

图7　pH对菌落生长和菌丝干质量的影响

2.2.4温度对菌丝生长和菌丝干质量的影响图8结果显示，在固体培养基和液体培养基中，在5～25 ℃范围内，立枯丝核菌的菌落直径和菌丝干质量均随温度的升高而增加，高于25 ℃时，均迅速下降.在本试验条件下，立枯丝核菌菌丝体生长的最适温度为25 ℃.

2.2.5通气状况对菌丝干质量的影响培养液的通气状况对病原菌的菌丝生长有显著的影响.从图9可知，当转速为80 r/min时，立枯丝核菌的菌丝干质量显著高于其他处理，高于或低于此转速都不适合菌丝生长.

图8　温度对菌落生长和菌丝干质量的影响

图9　通气状况对菌丝干质量的影响

3讨论与结论

经形态学鉴定和致病性测定，确定引起甘肃中部沿黄灌区马铃薯连作茎溃疡病的致病菌是丝核菌属的立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani).应用固体和液体两种培养方式研究发现：菌丝生长的最佳碳源是可溶性淀粉和蔗糖，最佳氮源是硝酸钾，这与刘志恒等[20]的研究结果一致；而本研究发现尿素对马铃薯立枯丝核菌菌丝生长有明显的抑制作用，与刘宝玉等[11]的研究报道中以尿素为氮源时有利于菌落生长有很大差别.分析其原因，可能是立枯丝核菌的菌丝融合群不同所致或地域差异所致，具体原因有待于进一步研究.

马铃薯立枯丝核菌生长的最适温度为25 ℃，低于5 ℃或者高于30 ℃菌丝都不生长，这与刘宝玉等[11]和Ritchie等[21]的研究结果基本一致.立枯丝核菌在固体培养基上当pH为6时生长最快，在液体培养条件下pH为7时生长最快.这与Ritchie[21]等报道的立枯丝核菌AG-3和AG2-1菌丝融合群生长最适的pH为5.6略有出入.当振荡频率为80 r/min时立枯丝核菌菌丝生长较好，这与大豆根腐病菌研究结果一致[22].

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(责任编辑胡文忠)

areas of Gansu Province

LU Xiao-qin1,2，LI Ya-juan3,ZHANG Wen-ming1,2，QIU Hui-zhen1,2，ZHANG Chun-hong1,2，

ZHU Jing1,2，WANG Di4,SHEN Qi-rong5

(1.College of Resources and Environmental Sciences，Lanzhou 730070,China；2.Gansu Provincial Key Lab of Aridland Crop

Science，Lanzhou 730070，China;3.College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;

4.Gansu Key Lab of Crop Improvement&Germplasm Enhancement,Lanzhou 730070，China;5.College of Resources

and Environmental Sciences,Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)

Abstract：The pathogen was successfully isolated from the diseased tissues of the field potato plant having the symptoms of stem canker,and it was proved to be the Rhizoctonia solani by means of morphological identification and pathogenicity determination.The biological characteristics of the pathogen were studied under the solid and liquid medium conditions,to clear the effects of incubating conditions(including carbon,nitrogen nutrients,temperature and pH on colony growth and mycelium dry weight of R.solani,The results showed that the optimum carbon sources for the pathogen colony growth on solid media were soluble starch and sucrose；the optimum nitrogen sources were potassium nitrate and peptone,and the best pH value was 6～7;in liquid media,soluble starch and potassium nitrate were also the optimum carbon and nitrogen sources for mycelium growth,and the most suitable pH value was 7.0,the optimum oscillation frequency was 80 r/min.The optimum temperature was 25 ℃ for the pathogen growth in both solid and liquid media.

Key words：potato stem canker;Rhizoctonia solani;biological characteristics

收稿日期：2014-03-24；修回日期：2014-04-21

基金项目：公益性行业( 农业) 科研专项(201103004)；国家自然基金(31360500)；国家科技支撑计划(2012BAD06B03)；甘肃省科技重大专项( 1102NKDM025) ．

通信作者：邱慧珍，女，教授，博士生导师，主要从事植物营养与营养生态的教学与科研工作.E-mail:hzqiu@ gsau.edu.cn

中图分类号：S 435.32

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)01-0084-05

第一作者：路小琴(1985-),女，硕士研究生，主要从事逆境胁迫与植物营养的研究.E-mail:luxq0428@163.com