GDC-0980对肺癌A549细胞凋亡及相关机制的研究

吴 松，薛 涛

（1江阴市人民医院胸心外科，江苏214400；2东南大学附属中大医院胸心外科）

GDC-0980对肺癌A549细胞凋亡及相关机制的研究

吴 松1*，薛 涛2

（1江阴市人民医院胸心外科，江苏214400；2东南大学附属中大医院胸心外科）

目的：探讨磷脂酰肌醇3磷酸激酶（PI3K）雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激酶（PI3K/mTOR）抑制剂GDC-0980对人肺腺癌细胞株A549细胞的诱导凋亡作用以及作用机制。方法：选择不同浓度GDC-0980作用于A549细胞48h后，通过CCK8法检测GDC-0980对A549细胞增殖的影响，应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞凋亡内标志物核小体的形成，采用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术以及免疫印迹法检测细胞凋亡。结果：GDC-0980能有效抑制A549细胞的增殖（66.61±5.72%），浓度越高抑制作用越强，抑制率可达66.61%。Annexin V-FITC/PI双染法染色显示，A549细胞膜发生翻转、破裂，最终导致凋亡。GDC-0980各浓度组凋亡率均显著增加，且随着GDC-0980浓度的增加，凋亡率也逐渐增加。结论：PI3K/mTOR抑制剂GDC-0980具有机制肺腺癌细胞株A549细胞生长、促凋亡的作用，并呈浓度依赖关系。

GDC-0980；人肺腺癌细胞株；细胞凋亡；抑制

1 材料与方法

1.1 材料 （1）细胞株来源：人肺腺癌细胞株A549（中国科学院上海细胞典藏库）。（2）主要试剂：PI3K/mTOR激酶双抑制剂GDC-0980（美国Selleck公司），F-12K细胞培养基（美国Gibco公司），兔抗人β-actin抗体（英国Abcam公司），CCK8检测试剂盒、脱氧核糖核酸(DNA)分子量标准、预染蛋白质分子量标准（碧云天生物技术研究所），Annexin VFITC/PI双染法检测细胞凋亡检测试剂盒（美国Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养：培养基为F-12K+10%的胎牛血清。传代时弃去培养液，0.25%胰酶消化，镜下观察细胞间已出现细胞胞质回缩变圆，缝隙变大，即可弃去消化液，PBS清洗1～2遍，加入培养基，吹打细胞然后分瓶。如果分瓶时细胞液不够，可再分别加入培养基，有80%～90%铺满培养瓶底即可传代，一瓶一般传3～4瓶，中间细胞培养48h后进行下列实验。

1.2.2 实验分组：在3组实验组中加入不同浓度GDC-0980：低浓度中加入GDC-0980组1 μmol/L；中浓度组中加入5 μmol/L；高浓度组加入20 μmol/L。设置对照组：仅加入细胞培养液，不加入GDC-0980。每组设6管，重复3次。

1.2.3 GDC-0980对A549细胞生长作用观察：将处于对数生长期的A549细胞，用移液器吹打成单细胞悬液，用计数板计数，然后计算并调整细胞悬液的细胞浓度。

1.2.4 各组细胞抑制情况检测：采用CCK8比色法测定在GDC-0980不同浓度作用下，检测细胞的增殖能力的变化。

1.2.5 酶联免疫吸附法（ELISA）测定核小体（Nucleosome）：核小体由DNA和组蛋白（Histone）构成。是约200 bp的DNA分子盘绕在由H2A、H2B、H3和H44种组蛋白八聚体构成的核心结构外面，形成了一个核小体。凋亡细胞细胞质内中由于DNA断裂出现核小体。ELISA法检测凋亡核小体敏感性高，是检测细胞凋亡的经典实验方法之一。

1.2.6 细胞凋亡检测：用F-12K培养基调整细胞浓度为1×106/mL后，接种于6孔培养板中，每孔1 mL，在37℃，5%CO2条件下培养过夜。在其中加入Annexin V-FITC每EP管5 μL，混匀后放置于4℃环境下避光孵育15 min。每管细胞悬液加入10 μL PI后，轻轻混匀于4℃避光条件下孵育5 min。用流式细胞仪测定细胞凋亡率。上述实验重复3次。

1.3 统计学处理 应用SPSS 20.0统计软件分析数据，采用均数±标准差（s）表示计量资料，用Oneway ANOVA方法，分析不同浓度实验组与对照组之间的差别。以P＜0.05为差异有统计学意义，以P＜0.01为有显著统计学差异。

2 结 果

2.1 不同浓度GDC-0980对A549细胞增殖的抑制本文采用的CCK8法是MTT的一种升级替代，比XTT、MTT或MTS等有明显的优点，检测灵敏度更高，更易溶解，并且更加稳定[2]。结果显示不同浓度的GDC-0980对A549细胞的增殖均有抑制作用。抑制率：对照组为2.31±1.95，1μmol/L浓度组为23.21± 3.02，5μmol/L浓度组为47.31±7.02，20μmol/L浓度组为66.61±5.72，与对照组比较具有统计学意义（P＜0.01），而且组间差异有统计学意义（P＜0.01）。最大抑制率可达66.61%，有一定的浓度剂量依赖性，随着给药浓度增加，抑制细胞增值作用越明显（图1）。

图1 GDC-0980对人肺癌细胞株A549细胞抑制率的结果直方图

2.2 ELISA法测定GDC-0980对A549细胞内核小体影响 对照组核小体为：0.27±0.18，1μmol/L、5μmol/L、20μmol/L浓度组核小体分别为：0.67±0.44、0.93±0.17、1.99±0.60，提示GDC-0980可明显促进A549细胞的凋亡，并且呈浓度依赖性（图2），GDC-0980组与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

图2 ELISA法测定GDC-0980对A549细胞内核小体结果（n=6）

2.3 检测细胞凋亡 细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine；PS）翻转到膜表面，采用FITC标记Annexin V可与凋亡细胞的PS相结合，从而使细胞核DNA红染[3]。对照F-12K凋亡率为：5.41%± 2.56%，1μmol/L、5μmol/L、20μmol/L浓度组分别为：14.11%±5.17%、38.96%±11.45%、55.73%±12.47%。GDC-0980各浓度组凋亡率均呈显著增加，且随着GDC-0980浓度的升高，凋亡率也逐渐增加（见图3）。

3 讨 论

图3 GDC-0980对A549细胞凋亡率的影响

PI3K-AKT-mTOR信号通路的持续活化在肿瘤的发生、发展、转移、浸润以及肿瘤炎症中起重要作用。PI3K/AKT下游关键激酶mTOR具有调节肿瘤细胞生长、增殖、存活、抵御死亡信号、血管生成的功能[4]。PI3K/mTOR抑制剂GDC-0980作用于PI3Kα/ β/δ/γ，高选择性作用于其他PIKK家族激酶。最近研究显示，PI3K-AKT-mTOR信号通路在肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）自我更新和分化以及抗放化疗中也发挥重要作用[5]，被认为是肿瘤复发和转移的一个重要原因。mTOR通路与肿瘤的发生、发展、转移有很重要的关系，在针对mTOR通路为靶点的药物研究中，发现大环内酯类抗生素雷帕霉素（rapamycin）可与胞浆中FK506结合蛋白12（FK506 binding protein 12，FKBP12）分子结合，形成雷帕霉素-FKBP12复合物，该复合物再与mTORC1结合，抑制mTOR通路，产生生物学效应[6-8]。

本实验采用CCK8实验证实不同浓度的GDC-0980对A549细胞的增殖均有抑制作用，当浓度为20μM时抑制率可达66.61%。与对照组相比较，GDC-0980处理A549细胞后各实验组均出现核小体，证实GDC-0980可以导致A549细胞的凋亡，并且呈浓度依赖性，GDC-0980浓度越高，导致A549细胞凋亡作用越强。但GDC-0980浓度继续增加例如增加到40μmol/L、80μmol/L，甚至更高浓度是否会对A549凋亡作用加强，仍有待进一步研究。

本实验证实PI3K/mTOR抑制剂GDC-0980对人肺腺癌A549细胞具有明显的抑制增殖以及促凋亡作用，但是在实验中GDC-0980是单一用药，抗肿瘤效果局限，并且在实验室中的作用效果与体内复杂的肿瘤微环境有很大区别，有待进一步深入研究。相信随着研究的深入会对肺癌的治疗起到一定程度的帮助，从而提高肺癌患者的诊治。

[1]Yap TA，Popat S.Toward precision medicine with next-generation EGFR inhibitors in non-small-cell lung cancer［J］. Pharmgenomics Pers Med，2014，7（7）：285-295.

[2]Zhang H，Gong J，Kong D，et al.Anti-proliferation effects of Twist gene silencing in gastric cancer SGC7901 cells［J］. World J Gastroenterol，2015，21（10）：2926-2936.

[3]Yu FX，Hu WJ，He B，et al.Bone marrow mesenchymal stem cells promote osteosarcoma cell proliferation and invasion［J］.World J Surg Oncol，2015，13：52.

[4]Yea SS，Fruman DA.Achieving cancer cell death with PI3K/ mTOR-targeted therapies［J］.Ann N Y Acad Sci，2013，1280（1280）：15-18.[5]Gomez-Pinillos A，Ferrari AC.mTOR signaling pathway and mTOR inhibitors in cancer therapy［J］.Hematol Oncol Clin North Am，2012，26（3）：483-505.

[6]Abdel-Magid AF.Combination therapy:JAK PI3K/mTOR.A Novel Approach for Cancer Treatment［J］.ACS Med Chem Lett，2013，4（5）：429-430.

[7]Hong SW，Shin JS，Moon JH，et al.NVP-BEZ235，a dual PI3K/mTOR inhibitor，induces cell death through alternate routes in prostate cancer cells depending on the PTEN genotype［J］.Apoptosis，2014，19（5）：895-904.

[8]Lin G，Gai R，Chen Z，et al.The dual PI3K/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 prevents epithelial-mesenchymal transition induced by hypoxia and TGF-β1［J］.Eur J Pharmacol，2014，729（729）：45-53.

Research on GDC-0980 induction of human glioma cell line A549 cells apoptosis and its related mechanism

WU Song1,XUE Tao2（1Department of cardiothoracic surgery,the Affiliated Jiangyin Hospital of Southest University Medical College,Jiangsu 214400;2Department of cardiothoracic surgery,The Affiliated Zhongda Hospital of Southest University Medical College)

Objective:To study the effects of phosphatidylinositide 3-kinases/mammalian target of rapamycin kinase inhibitor GDC-0980 on induction of apoptosis and its possible mechanisms in human glioma A549 cells.Methods:The A549 cells were treated with different concentrations of GDC-0980 for 48 hrs.The effects of BKM on cell proliferation were detected by CCK8 kit.The nucleosome was detected by ELISA kit.The cell apoptosis was detected by Annexin VFITC/PI staining.Results:The resulting form CCK8 test suggested that GDC-0980 can inhibit A549 proliferation in a concentration dependent manner and the maximum inhibitory rate is 66.61%(66.61±5.72%).ELISA showed the change of A549 cell morphology including nucleosome after incubation with GDC-0980.The result of flow cytometry detected showed that A549 cells apoptosis ratio gradually increased when the concentration of GDC-0980 increased.Conclusion:GDC-0980 can inhibit the proliferation of A549 cells significantly.GDC-0980 can induce apoptosis of A549 cells in a concentration dependent manner.

GDC-0980;Human lung adenocarcinoma cell line A549;apoptosis;inhibition

R734.2

A

吴松，男，汉族，江苏江阴人，生于1971年5月，本科，学士，主任医师。研究方向：肺癌的基础与临床研究。

1006-2440（2015）04-0326-04

肺癌的发病率、死亡率近年来被认为占各肿瘤的首位，在过去的10年中，全球肺癌的发病率每年以22%的速度在飞快上升，每年全球因肺癌死亡的患者达一百多万。肺癌患者就诊时往往已中晚期，治疗方式主要为手术结合放化疗，但中晚期肺癌治疗效果较差，5年生存期低于30%。基于此，全球范围内广泛开展对肺癌的研究，但关于PI3K/mTOR抑制剂GDC-0980在肺癌中的研究报道较少。磷脂酰肌醇3磷酸激酶（phosphoinositide 3-kinases，PI3K）是一个脂激酶家族，雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K信号通路的一个关键节点。肿瘤细胞中mTOR信号通路经常出现异常活化[1]。本研究选用PI3K/mTOR抑制剂GDC-0980作为诱导药物，以人肺腺癌细胞株A549为研究对象，为治疗肺癌设计新的治疗方案提供理论依据。