胸腹水中提高肿瘤细胞检出率方法的探讨

谭卫峰，刘庆猛，石丹

（绍兴第二医院，浙江 绍兴312000）

胸腹水中提高肿瘤细胞检出率方法的探讨

谭卫峰，刘庆猛，石丹

（绍兴第二医院，浙江 绍兴312000）

目的探讨胸、腹水中提高肿瘤细胞检出率的方法。方法收集本院2013年1月～2014年1月期间胸、腹水67例，其中胸水45例，腹水22例，分别进行常规涂片、细胞块连续切片以及细胞块免疫细胞化学染色三种方法的比较，分析三种方法的肿瘤细胞检出率之间的区别。结果细胞块免疫细胞化学染色的肿瘤细胞检出率要高于常规涂片和细胞块连续切片法，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论胸腹水进行离心沉淀后制作细胞块，进行免疫细胞化学染色，能明显提高恶性胸腹水的肿瘤细胞检出率。

胸腹水；细胞块；免疫组化；检出率

传统细胞学检查是指临床送检的胸腹水经离心沉渣后直接涂片HE染色，这种方式简单方便，但是阳性检出率低，容易漏诊。本院采用的是SHANDON公司Cytospin3细胞离心机，制成涂片，镜下观察优于传统直接涂片，但也会丢失部分肿瘤细胞，对于肿瘤细胞的分型和来源是无法判断的。而胸腹水离心沉淀后，沉渣制作细胞块，常规连续切片进行常规HE染色，进行镜下观察，细胞形态真实，大多可见组织结构；常规沉渣石蜡切片后免疫细胞化学染色，能有效地解决常规涂片两个问题：肿瘤细胞的收集和来源分型判断[1]。本文比较常规涂片、细胞块连续切片以及细胞块免疫细胞化学染色三种方法的肿瘤细胞检出率，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集本院2013年1月～2014年1月期间胸腹水67例，其中胸水45例，腹水22例，男30例，女37例，年龄41～83岁，平均 （62.4± 10.53）岁。分别用Cytospin3细胞离心机常规涂片、细胞块石蜡包埋切片以及常规切片后迈新公司EliVision二步法免疫组化染色。

1.2方法

1.2.1传统涂片HE染色 全部67例胸腹水用国产台式离心机3000转/min离心5分钟后，取接近沉淀上清液0.5mL，Cytospin3细胞离心机常规涂片后进行HE染色，光镜下细胞学诊断（见图1）。判断标准：光镜下肿瘤细胞细胞核增大、染色质增粗、核浆比增高、核仁明显。

1.2.2胸腹水细胞块制备及HE染色 沉淀部分在弃去上清液后，沿试管侧壁缓慢滴入95%酒精，与沉渣的比例约为1:4～5，然后静置固定24小时，倒去酒精，用尖头竹棒轻轻挑出沉淀物后用包埋纸包裹，常规脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋连续切片[2]（见图2）。判断标准：细胞块连续切片下肿瘤细胞呈巢状分布，部分形成腺样结构，细胞异型明显，核浆比高、可见核分裂[3]。

1.2.3细胞块免疫细胞化学染色标记 用迈新公司EliVision二步法免疫组化染色，细胞块常规连续切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，用PBS（pH7.4）冲洗3次，每次3分钟；根据每种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复；如果有必要，每张切片加1滴或50μL的3%H202，室温孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，除去PBS液，每张印片加1滴或50μL第一抗体，室温孵育60分钟；PBS冲洗后，每张印片加1滴或50μL聚合物增强型（试剂A），室温孵育20分钟。PBS冲洗后，每张切片加1滴或50μL酶标抗鼠／兔聚合物（试剂B），室温孵育30分钟。PBS冲洗后，每张切片加1滴或50μL新鲜配制的DAB，显微镜观察3～5分钟；自来水冲洗，苏木素复染，用0.1%HCl酒精分化自来水冲洗，PBS返蓝，经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。检测的抗体为：CK19、CK（L）、TTF1、CK8、CEA、Moc-31；判读标准：CK19、CK（L）、CK8、CEA、Moc-31均为细胞质着色，TTF1为细胞核着色。免疫组化染色结果（见图3～8）。细胞块免疫组化染色后，CK19、CK（L）、CK8、CEA、Moc-31均为细胞质着色，TTF1细胞核着色，定位准确、阳性表达强。

1.3统计学处理 采用SPSS18.0软件进行统计分析，三种方法肿瘤细胞检出率两两比较，采用列联表χ2检验。

2 结果

2.1三种方法的肿瘤细胞检出率比较 直接涂片法与细胞块切片法比较，差异无统计学意义 （χ2= 2.555，P=0.182）；直接涂片法与细胞块免疫细胞化学染色法比较，差异有统计学意义 （χ2=32.074，P= 0.000）；细胞块切片法与细胞块免疫细胞化学染色法比较，差异有统计学意义（χ2=19.067，P=0.000），见表1。

表1 胸腹水中三种方法的肿瘤细胞检出率的比较（n，%）

2.2组织病理学检查 67例细胞块免疫细胞化学染色法检出恶性肿瘤细胞35例，均经过组织病理学诊断证实。

3 讨论

胸腹水细胞学检查为病理科日常工作，但部分胸腹水受其他因素的影响，对作出正确的诊断带来一定的困难。如间皮细胞分布胸腔、腹腔，间皮细胞的增生可见多核细胞，由小到大形态多样；细胞从未分化到分化成熟，核浆比从大到小，核仁从不明显到大，不典型增生的间皮细胞常成团存在，也有散在，核深染增大表现为桑葚样、球样、腺样或滤泡样、小梁和乳头状等结构，也可见核分裂象，炎性胸腹水增生或退变的间皮细胞与某些恶性肿瘤细胞尤其是腺癌细胞在形态上易于混淆，因此，在胸腹水中，间皮细胞的存在很容易造成假阳性诊断[4]。本文胸、腹水67例，分别进行常规涂片、细胞块连续切片、细胞块免疫细胞化学染色三种方法进行染色，根据三种方法各自的判断标准进行判读，直接涂片找到恶性肿瘤细胞5例、可疑肿瘤细胞12例、未检出肿瘤细胞50例，细胞块连续切片找到恶性肿瘤细胞11例、可疑肿瘤细胞18例、未检出肿瘤细胞38例，细胞块免疫细胞化学染色找到恶性肿瘤细胞35例、可疑肿瘤细胞14例、未检出肿瘤细胞18例，三组恶性肿瘤细胞检出率比较，差异有统计学意义，与尚士宣等[5]报道相仿。

胸腹水常规直接涂片比较单一、局限，细胞涂片只能提供一次性的诊断需要，没有后续的储备利用；而细胞蜡块制作简单，对设备要求低，在病理科现有常规设备下，完全能够制作完成。收集的细胞较常规涂片多而且相对集中，易于观察肿瘤的组织形态，可以增加肿瘤脱落细胞的诊断价值。另外细胞蜡块可制成多张切片，长期保存，进行一系列组织化学和免疫组化染色，作电镜、PCR检查，进行分子病理学诊断和研究，有助于诊断和分型诊断：如Calretinin、Vimentin、MC阳性多提示增生的间皮细胞；CK7、TTF-1、Napsin-A阳性多提示肿瘤细胞来源于肺；CK7、CA125阳性多提示肿瘤细胞来源于卵巢；CDX2、CK20阳性提示肿瘤细胞来源于胃肠道[6]；对于一些抗体的组织特异性并非绝对的，可以进行多种抗体联合进行免疫细胞化学染色并设立对照，有助于解决特异性不高的问题。

鉴于直接涂片、细胞块连续切片和细胞块免疫细胞化学染色各自的优缺点，作者采用的方法是：先直接涂片进行筛选，对于细胞有异型或

图1 200倍镜下直接涂片肿瘤细胞：细胞核增大、染色质增粗、核浆比增高、核仁明显。

图2 200倍镜下细胞块连续切片肿瘤细胞：呈巢状分布，部分形成腺样结构，细胞异型明显，核浆比高、可见核分裂。

图3 细胞块酶标CK19阳性

图4 细胞块酶标CK（L）阳性

图5 细胞块酶标TTF1阳性

图6 细胞块酶标CK8阳性

图7 细胞块酶标CEA阳性

图8 细胞块酶标Moc-31阳性

高度怀疑的胸腹水，进行细胞块的HE切片观察，结合免疫组化染色结果，判读胸腹水中是否找到肿瘤细胞，以及根据免疫组化的结果提示肿瘤细胞的分类及来源。这样可以避免异型的间皮细胞对于诊断结果的影响，取得比较满意的结果。

综上所述，在诊断细胞学不断发展的前景下，细胞块免疫细胞化学染色法具有肿瘤细胞检出率高、肿瘤细胞分型诊断以及后续的利用范围广等优势，越来越受到临床医生的重视，技术也会不断的完善。

[1] 毛瑛玉，杨敏，刘冬戈，等.细胞块切片免疫细胞化学染色在浆膜腔积液细胞学诊断中的应用.中华病理学杂志，2009，38（8）:547

[2] 张婉仪，罗丽花，刘惠娟，等.胸腹水细胞块制作技术及应用.临床医学工程，2014，1（21）:44

[3] 朱利，刘双元，冯君，等.胸腹水沉渣切片对肿瘤细胞诊断的意义.临床和实验医学杂志，2011，10（13）:1037

[4] 宋新兰，付娟娟.全自动免疫组化染色仪在胸腹水脱落细胞诊断中的应用价值.诊断病理学杂志，2013，5（20）：313

[5] 尚士宣，赵晓丹，肖月英.细胞块切片免疫组化染色在肿瘤细胞学诊断中的应用.肿瘤基础与临床，2012，23（6）:514

[6] 石龙姣.免疫细胞化学在胸腹水肿瘤细胞学诊断中的应用.医学理论与实践，2013，26（6）:721