乳腺癌新辅助化疗前后相关miRNA差异表达研究

谢小红 顾锡冬 赵虹 洪日 胡袁媛 许雷来

乳腺癌新辅助化疗前后相关miRNA差异表达研究

谢小红 顾锡冬 赵虹 洪日 胡袁媛 许雷来

目的 探究乳腺癌新辅助化疗疗效新的评价指标。方法 定量PCR分析15例采用FEC方案化疗的乳腺癌患者化疗前后乳腺癌组织中miR-125、miR-145、miR-155、miR-210、miR-203以及miR-let-7的表达情况。结果 与化疗前比较，患者化疗后miR-125、miR-155、miR-203以及miR-let-7表达水平差异均无统计学意义（均P＞0.05），但化疗后miR-145表达水平升高而miR-210下降，与化疗前比较均有统计学差异（均P＜0.05）。结论 FEC方案治疗后，患者乳腺癌组织内miR-145表达水平显著升高而miR-210表达水平显著下降，可能与患者化疗效果相关。miR-145和miR-210可能可以用于化疗效果的预测。

乳腺癌 新辅助化疗 miRNA miR-145 miR-210

美国癌症协会发布的癌症统计预期数据显示，乳腺癌的发病率居于女性恶性肿瘤的首位，全球每年约有120万妇女患乳腺癌，占所有女性新发恶性肿瘤的29%。我国北京、上海等大城市的统计结果显示乳腺癌同样是我国女性最常见的恶性肿瘤，发病人数每年新增3%~4%，超过世界水平的1%~2%[1]。据《浙江省肿瘤登记地区2010年癌症发病与死亡分析》[2]报道，浙江省乳腺癌发病率47.80/10万，高于全国水平，严重威胁着女性的健康和生命。虽然随着诊疗技术的进步，早期乳腺癌的检出率已经大幅提高，但是临床上局部晚期乳腺癌仍然常见。对于这部分患者，新辅助化疗是目前公认的最有效的治疗方法，而目前临床上对于新辅助化疗的效果评判主要还是依靠临床体检和影像学判断，缺乏更科学的判断标准。

miRNA是长约20~24nt的小单链非编码RNA，在人体中广泛参与一系列生理过程的调控，包括器官发育[3]、细胞分化[4]、免疫反应[5]和肿瘤形成[6]等。通过文献复习，笔者选择了6个与乳腺癌相关性较强的miRNA作为研究目标，希望通过观察化疗前后患者乳腺癌组织中miRNA的变化，试图为新辅助化疗寻求新的疗效指标。

1 资料和方法

1.1 一般资料 筛选2013年4月至2014年2月于本院初诊的乳腺癌患者15例，均为女性，年龄32~68岁，平均50.5岁；TNM分期在Ⅲa以上。患者术前均行粗针穿刺组织活检，病理诊断为乳腺浸润性导管癌。诊断明确后予FEC方案化疗3个周期，临床评估均达部分缓解（PR）后行手术治疗，术中留取肿瘤组织。入组患者化疗前后的病理组织均取自临床癌肿中心区域（癌肿核心区），标本大小约1cm3，置于冻存管中，液氮速冻之后转移至-80℃冰箱保存。化疗采用中心静脉注射，方案为FEC方案，具体为：环磷酰胺500mg/m2d1+表柔比星100mg/m2d1+5-氟尿嘧啶（5-Fu）500mg/m2d1，21d为1个化疗周期；其中表柔比星最高剂量不超过140mg/次。化疗3个周期后所有患者均顺利接受手术治疗。

1.2 主要试剂 5mg/ml溴化乙锭（EB）、50×TAE核酸电泳缓冲液母液、DEPC水、EDTA和Tris购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司，固相RNase清除剂为北京天恩泽基因科技有限公司产品。环磷酰胺注射液由浙江海正药业股份有限公司生产（批号：04150603），表柔比星由辉瑞制药（无锡）有限公司生产（批号：L62525），5-Fu由武汉欣欣佳丽生物科技有限公司生产（批号：1404141）。SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）为日本Takara公司产品，Rever-Tra-Ace-α-Transcriptase为东洋纺（上海）生物科技有限公司产品。

1.3 定量PCR检测 手术前穿刺获取患者肿瘤中心部位的乳腺癌组织，化疗后进行肿瘤切除手术时再次取患者肿瘤中心部位的组织样本。以Trizol试剂提取总RNA，选取OD260/OD280为1.9~2.0，28S rRNA/ 18S rRNA为1.8~2的样品进行定量PCR。首先对RNA样品进行PolyA加尾，37℃反应15min后立即使用或者-80℃保存。采用Rever-Tra-Ace-α-Transcriptase进行逆转录，逆转录上游引物序列如表1，所需引物由英潍捷基公司和生工生物公司合成。下游引物序列为锚定引物序列（序列专利保密）。U6作为内参基因，扩增效率1.95~2.05，熔解曲线为单峰（见图1），无引物二聚体。逆转录反应完成后，采用SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）进行定量PCR反应。所有的反应重复3次。结果处理按照2-ΔΔCT法：首先计算出每个标本目的基因及内参基因U6的Ct值，ΔCT=Ct（目的基因）-Ct（U6），再按照ΔΔCT=ΔCT（化疗前）-ΔCT（化疗后）计算出化疗前后各目的基因表达的差异[7]。

1.4 统计学处理 应用Origin software 9.0和Excel software统计软件，计量资料以表示，组间比较采用Student t检验。

2 结果

对比15例乳腺癌患者化疗前后肿瘤原发部位的miRNA表达水平发现，化疗后miR-145表达水平明显升高而miR-210表达明显下降（均P＜0.05），而其余几项miRNA表达水平与化疗前比较均无统计学差异（均P＞0.05），见表2。

表1 定量PCR所需引物

表2 患者化疗前后相关miRNA表达比较

3 讨论

miRNA虽然发现较晚，但2005年以后大量的研究将miRNA引入肿瘤研究的领域。miRNA调控肿瘤形成和发展的机制逐渐被人们揭示而且成为了肿瘤治疗的靶点。同时，越来越多的研究表明miRNA可以作为独立的预后因子预测肿瘤的恶性程度以及预后。

本研究中笔者试图研究miRNA作为新辅助化疗效果的“指示剂”的可能性。结果发现，15例患者化疗后都呈现miR-145上调。miR-145原本是抑癌基因，在三阴性乳腺癌中显著下调[8]。笔者既往研究表明miR-145表达水平在乳腺癌中显著下调，患者化疗后miR-145表达水平发生显著上调，某种程度上也预示着化疗对肿瘤的清除较为有效，因此笔者推测miR-145有可能可以预示肿瘤的治疗效果。同样，既往研究发现乳腺癌中miR-210表达水平显著上调[9]，而本研究提示患者化疗之后miR-210表达呈现下调的趋势，这也表明miR-210也可能成为化疗效果评价的一个预测因子。

miR-145定位于染色体5q32-33，通过靶向N-ras基因调控血管内皮生长因子（AVEGF-A）的表达来抑制乳腺癌组织血管生成，从而抑制乳腺癌细胞的增殖和转移[10]。作为抑癌基因，miR-145在三阴性乳腺癌中明显下调[9]。Hong等[11]研究发现抑制miR-145的生物合成，能够促进c-myc的表达，而后者通过抑制p38 MAPK从而促进乳腺癌细胞和野生型小鼠胚胎成纤维细胞株MEFs细胞的增殖。Kim等[12]运用腺病毒载体过表达miR-145与5-Fu联合治疗原位乳腺癌的小鼠可以显著提高5-Fu的抗肿瘤效果。

图1 各miRNA定量PCR的熔解曲线和扩增曲线（A：miR-125熔解曲线；B：miR-125扩增曲线；C：miR-145熔解曲线；D：miR-145扩增曲线；E：miR-155熔解曲线；F：miR-155扩增曲线；G：miR-203熔解曲线；H：miR-203扩增曲线；I：miR-210熔解曲线；J：miR-210扩增曲线；K：miR-let-7a熔解曲线；L：miR-let-7a扩增曲线；M：U6熔解曲线；N：U6扩增曲线）

miR-210是一个原癌基因，有研究证实，在很多实体肿瘤包括乳腺癌中miR-210普遍呈高表达，并且与乳腺癌的不良预后有关[13]。肿瘤干细胞的存在是肿瘤逃避化疗药物，发生侵袭、转移的重要原因，低氧微环境有利于肿瘤干细胞的生长，低氧微环境能够诱导产生缺氧诱导因子（HIF），29%的原发性乳腺癌中HIF-1α高表达，而转移瘤中69%的HIF-1α高表达。在低氧环境下HIF-1α能够介导miR-210表达上调[14-17]，导致肿瘤发生[18]。一方面，miR-210能促进肿瘤体内毛细血管生成，提高肿瘤转移能力；另一方面，miR-210能够靶向抑制琥珀酸脱氢酶亚单位SDHD，从而抑制了三羧酸循环这一有氧代谢途径，从而导致细胞的无氧代谢途径更加活跃，进一步激活HIF-1，形成一个正反馈环路不断激活该途径[15]。miR-210还能直接抑制c-myc的拮抗剂Max结合蛋白（MNT）的表达以促进基因转录并加速细胞周期[19]，以及通过抑制靶向半胱氨酸蛋白酶8相关蛋白2（CASP8AP2）表达从而抑制缺氧适应的肿瘤干细胞凋亡。

新辅助化疗是局部晚期乳腺癌的标准化治疗，但目前临床对疗效的评估尚缺乏精确而科学的方法。本研究发现FEC方案新辅助化疗后乳腺癌组织中miR-145的表达水平显著升高而miR-210的表达水平显著下降，提示可能与乳腺癌化疗效果相关。笔者推测，化疗前后乳腺癌组织中miR-145和miR-210的变化可能可以用于化疗疗效预测，但本研究样本量偏少，有待扩大样本以及依据乳腺癌的不同分子分型进行进一步研究。

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Differential expression of miRNA in breast cancer before and after neoadjuvant chemotherapy

XIE Xiaohong,GU Xidong,ZHAO Hong,et al.Department of Breast Surgery,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310006, China

Breastcancer Neoad juvant chemotherapy miRNA miR-145 miR-210

2015-06-16）

（本文编辑：胥昀）

浙江省自然科学基金（LY12H 16008）

310006杭州，浙江中医药大学附属第一医院乳腺科

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of miRNA in breast cancer before and after neoadjuvant chemotherapy. Methods Tissue samples were collected from 15 patients with breast cancer before and after neoadjuvant chemotherapy of FEC regime,and the expressions of miR-125,miR-145,miR-155,miR-210,miR-203 and miR-let-7 were detected with quantitative PCR analysis. Results There were no significant differences in expressions of miR-125,miR-155, miR-203 and miR-let-7 before and after chemotherapy,while the expression of miR-145 was increased and the expression of miR-210 was decreased(both P＜0.05). Conclusion The expressions of miR-145 and miR-210 were significantly changed in breast cancer after chemotherapy with FEC scheme.