控制性超排卵对胚胎植入前小鼠子宫内膜蛋白质表达的影响

周文静 冯颖 沈蓉蓉 费小阳

控制性超排卵对胚胎植入前小鼠子宫内膜蛋白质表达的影响

周文静 冯颖 沈蓉蓉 费小阳

目的 研究控制性超排卵（COH）对胚胎植入前小鼠子宫内膜蛋白质表达的影响，探讨体外受精-胚胎移植时子宫内膜容受性的生物学标志物。方法 将12只ICR雌性小鼠随机分为实验组和对照组，每组6只。实验组采取促排卵措施，对照组未作任何处理。通过双向电泳和质谱分析技术研究COH对小鼠子宫内膜蛋白表达的影响。结果 实验组蛋白电泳图谱与对照组有明显差异，2倍以上差异表达蛋白总数为89个。截取其中16个蛋白质点进行了质谱分析，检测出9种有意义的差异表达蛋白。结论 COH可导致子宫内膜多种蛋白质表达改变，通过筛选子宫内膜容受性的生物学标志物，可以为提高COH周期的胚胎种植率和妊娠率提供理论依据。

胚胎植入 控制性超排卵 子宫内膜 小鼠

子宫内膜容受性是决定胚胎着床的关键因素。控制性超排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）周期是使用大量促性腺激素，引起多个卵泡同时发育，使机体出现雌激素水平异常升高以及雌孕激素比例失调。这些激素水平的改变可能影响子宫内膜对胚胎的容受性，最终导致妊娠失败。这可能是由于子宫内膜中一些基因发生差异表达，从而导致激素、细胞因子、黏附分子及糖蛋白等多种蛋白分子的表达发生显著性改变[1-2]。为了解自然状态与超排卵状态下胚胎植入前小鼠子宫内膜的蛋白质差异及可能导致的妊娠结局，本研究采用蛋白质组学研究方法，应用双向电泳、免疫印迹和质谱分析技术分析两种状态下主要差异蛋白，以期为体外受精-胚胎移植研究提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料 12只均为6周龄的健康雌性ICR小鼠按随机数字表法分为实验组和对照组，每组6只。实验组小鼠体重（25.4±2.8）g，对照组小鼠体重（26.3±3.0）g，两组小鼠体重无统计学差异（P＞0.05）。实验组腹腔注射孕马血清（PMSG，丽珠集团丽珠制药厂，50IU/0.2ml）10 IU/只，48h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素（HCG，丽珠集团丽珠制药厂，50IU/0.2ml）10 IU/只。对照组不作任何处理。注射HCG后第2天同时处死两组小鼠，取出子宫；用眼科镊夹住单侧子宫角，用弯头镊从近输卵管端向子宫颈方向挤压滚动获取子宫内膜；4℃的0.9%氯化钠溶液反复冲洗组织，滤纸吸干后分装至EP管并置于液氮罐中保存。

1.2 蛋白提取及定量 将冷冻的内膜组织取出并充分研磨，加入裂解液，30℃恒温水浴1h以充分溶解蛋白；15 000g离心15min，收集上清液；将收集的上清液再次离心以充分去除不溶性杂质，获取子宫内膜组织的蛋白提取液；采用Bradford法测定蛋白浓度。

1.3 双向电泳分离 对蛋白提取液进行等电聚焦电泳和十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳，每组3次重复上样检测。电泳结束后采用考马斯亮蓝染色法对凝胶进行染色。染色后的凝胶应用Image Scanner扫描仪进行扫描，采用PDquest8.0软件对图像进行分析，包括凝胶蛋白点检测、图像背景扣除、蛋白点灰度值标准化、不同凝胶间蛋白点匹配。比较两组的双向电泳图片进行，以变化倍数＞2倍且P＜0.05为标准筛选差异蛋白。

1.4 质谱分析 将凝胶上切取的蛋白点进行漂洗、考染、酶解、萃取、冻干、加入基质和质谱靶点样等操作；使用ABI5800串联飞行时间质谱仪进行质谱点靶鉴定；根据数据进行蛋白质数据库验证。

2 结果

2.1 蛋白双向电泳图谱分析 两组的电泳图谱均有很好的重复性，图谱大体一致，小鼠子宫内膜组织蛋白质分子量主要集中在14.4~116 kDa，等电点主要分布在pH 4.0~9.0。实验组与对照组相比，2倍以上差异表达蛋白总数为89个，其中上调表达75个，下调表达14个。两组小鼠子宫内膜蛋白电泳图谱及差异蛋白标注见图1。

图1 两组小鼠子宫内膜蛋白电泳图谱及差异蛋白标注（a：实验组；b：对照组）

2.2 差异蛋白质谱分析 从89个差异蛋白中选取16个蛋白质点进行了质谱分析，经过查找和确认，其中7个下调的蛋白质点均鉴定为血清蛋白干扰，共检测出9种有意义的差异表达蛋白，其中上调蛋白8个，下调蛋白1个，详见表1。

表1 9种有意义的差异蛋白

3 讨论

体外授精-胚胎移植的胚胎种植率目前仍停留在低水平，据统计由于子宫内膜容受性原因导致的着床失败占2/3左右，大大限制了辅助生育技术的成功率[2]。评价子宫内膜-胚胎发育同步与否和筛选其标志物指导临床选择胚胎移植时机，是提高妊娠率的研究方向之一。

有研究表明不孕症人群与正常生育人群的子宫内膜蛋白质存在一定的差异[3]，这说明功能蛋白在子宫内膜容受性的调节中起着重要作用。在体外授精－胚胎移植的过程中，促排卵药物的使用，对子宫内膜的容受性造成一定的影响，导致子宫内膜和胚胎发育不同步，影响胚胎着床[3]。谭真等[4]通过比较自然周期胚胎植入窗口前期和植入窗口期的子宫内膜的蛋白质组成，发现存在差异的蛋白质点共31个，其中17个上调表达，14个下调表达。涉及到细胞迁移与融合、酶活性改变、信号转导与基因调控、免疫调节、血管生成和凝血纤溶等6个系统。子宫内膜上皮细胞吞饮泡、整合素αVβ3、白血病抑制因子、血管内皮生长因子的表达可以部分地反映子宫内膜对胚胎的容受性。但至今为止，还未能找到更完整的、能动态反映子宫内膜对胚胎容受性变化的方法。

本研究中上调倍数较高的谷胱甘肽转移酶属于子宫内膜的分泌蛋白，在孕激素产生旺盛的黄体细胞和卵泡膜细胞均含有，提示其在卵巢合成甾体激素,特别是孕酮的产生过程中起重要作用。谷胱甘肽转移酶还与细胞的凋亡调控有关，可以促进子宫内膜细胞凋亡，帮助内膜做好胚胎着床前的准备。另一上调倍数较高的蛋白为视黄醛脱氢酶2，是合成视黄酸所必须的酶,也是启动减数分裂的关键信号，可以促进卵巢合成视黄酸启动减数分裂。实验组小鼠子宫内膜角蛋白，I型细胞骨架蛋白表达是对照组的3.1倍，在刘倍余等[5]的研究中也发现胚胎反复种植失败的妇女种植窗时期子宫内膜的细胞骨架蛋白质存在异常表达，这与国外一些学者的研究结果一致[6]。

本研究结果中唯一的下调蛋白是抗胰蛋白酶1-3，在人类子宫内膜检测证实α1抗胰蛋白酶是在分泌期和种植窗期高表达的[7]，说明其与子宫内膜容受性呈正相关，α1抗胰蛋白酶可以通过抑制蛋白酶活性，参与子宫内膜微环境的蛋白水解，可能可以作为子宫内膜容受性的生物学标志物，具体机制尚有待进一步研究。

长期以来，胚胎着床的分子机制一直都是生殖生物学领域的研究热点。胚胎着床是由多种因素协同作用的复杂过程，各种因子处在这一调控网络的各个结点上，与其他结点上的因子相互联系，相互制约。其中激素及其它着床因子的相互作用和它们在胚胎着床调节链中的位置、作用途径还有待进一步探讨。如可通过监测各种生长因子的水平了解胚胎的发育情况、着床潜力等，从而使其成为研究胚胎着床机制的切入点，可为提高COH周期的胚胎种植率和妊娠率提供理论依据和借鉴。今后可选取其中几个差异蛋白进行种植窗期在体子宫内膜组织表达的定位和半定量验证，以进一步研究探讨其在调节子宫内膜容受性方面的作用。

[1] Horcajadas J A,Riesewijk A,Polman J,et al.Effect of controlled ovarian hyperstimulation in IVF on endometrial gene expression profiles[J].Mol Hum Rep rod,2005,11(3):195-205.

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[3] Ledee-Bataille N,Lapree-Delage G,Taup in J L,et al.Concen-tration of leukaemia inhibitory factorLIF inuterine flushing Fluid is highly predictive of embryo implantation[J].Hum Reprod, 2002,17(1):213-218.

[4] 谭真,李洁,黎明涛,等."种植窗"时期人类子宫内膜组织差异蛋白质表达谱的初步研究[J].中国病理生理杂志,2012,28(2):201-206.

[5] 刘倍余,李洁,刘明涛,等.反复种植失败妇女"种植窗"时期子宫内膜组织的细胞骨架蛋白质的差异表达 [J].生殖医学杂志,2014,23(11): 907-912.

[6] Rai P,Kota V,Sundaram C S,et al.Proteome of human endometrium:Identification of differentially expressed proteins in proliferative and secretory phase endometrium[J].Proteomics Clin Appl,2010,4(1):48-59.

[7] Parmar T,Gadkar-Sable S,Savardekar L,et al.Protein profiling of human endometrial tissues in the midsecretory and prolif-erativephases of the menstrual cycle[J].Fertil Steril,2009,92(3): 1091-1103.

Effect of controlled ovarian hyperstimulation on expression of protein profile in preimplanted endometrium of mice

ZHOU Wenjing，FENG Ying，SHEN Rongrong，et al.Department of Reproduction,Hangzhou Maternity Hospital，Hangzhou 310009,China

Objective To investigate the effect of controlled ovarian hyperstimulation(COH)on expression of protein profile in preimplanted endometrium of mice.Methods Twelve ICR mice were randomly divided into experimental and control groups, COH was given to mice in experimental group.Differential expression of proteins in preimplanted endometrium was analyzed by using two-dimensional gel electrophoresis (2D-DIGE)and matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS).Results There were 89 proteins differentially expressed＞2 fold in the endometrium between experimental group and control group.Among 89 differentially expressed proteins 16 were further examined with MALDI-TOF-MS and 9 significantly expressed proteins were found.Conclusion Controlled ovarian stimulation can lead to changes in expression of protein profile on the preimplanted endometrium of mice,and screening of endometrial receptivity markers may facilitate to raise the implantation and pregnancy rate.

Embryo implantation Controlled ovarian hyperstimulation Endometrium Mice

2015-07-08）

（本文编辑：李媚）

浙江省人口计生委科研项目（JSW 2013-A036）

310009杭州市妇产科医院生殖中心

费小阳，E-mail：feixy1962@163.com