壮药白花九里明提取物急性毒性和体内抗菌作用的研究

宁 天，黄维真，宁小清，李军芳，梁 红，张 清，黄薏霏

(1. 广西卫生职业技术学院，广西 南宁 530023；2. 广西壮族自治区妇幼保健院/妇产医院，广西 南宁 530003；3. 广西中医药大学药学院，广西 南宁 530001；4. 广西南宁市妇幼保健院，广西 南宁 530002)

论 著

壮药白花九里明提取物急性毒性和体内抗菌作用的研究

宁 天1，黄维真2，宁小清3，李军芳3，梁 红1，张 清2，黄薏霏4

(1. 广西卫生职业技术学院，广西 南宁 530023；2. 广西壮族自治区妇幼保健院/妇产医院，广西 南宁 530003；3. 广西中医药大学药学院，广西 南宁 530001；4. 广西南宁市妇幼保健院，广西 南宁 530002)

[摘要]目的 研究壮药白花九里明提取物的急性毒性和体内抗菌的作用。方法 序贯法测定壮药白花九里明水、醇提物对小鼠的急性毒性；感染动物保护实验测定壮药白花九里明不同剂量水提物对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌感染的小鼠体内保护作用。结果 壮药白花九里明水提取物小鼠灌胃的LD50为(134.17±9.043)g生药/kg，95%的可信区间为(125.127，143.213)；醇提取物LD50为(107.37±17.665)g生药/kg，95%的可信区间为(89.705，125.035)。壮药白花九里明水提物6.7 g/kg、13.4 g/kg、26.8 g/kg均能不同程度地降低金黄色葡萄球菌感染小鼠的病死率并延长平均存活时间。结论 壮药白花九里明提取物为低毒，大剂量服用比较安全；对金黄色葡萄球菌感染的小鼠有一定的体内保护作用，值得进一步研究与开发。

壮药白花九里明；急性毒性；体内抗菌；抗菌作用

壮药白花九里明来源于菊科艾纳香属植物东风草[Blumeamegacephala(Randeria)ChangetTseng]干燥全草入药，味苦、微辛，性凉，具有清热明目、祛风止痒、解毒消肿之功效，主治目赤肿痛、翳膜遮睛、风疹、疥疮、跌打红肿等[1]。艾纳香属植物有抗菌作用，如Geda等[2]报道艾纳香属中二叶艾纳香(Blumea bifoliata)叶片水提物的伯克B.membranacea挥发油有抗真菌作用，对其反应最敏感的是支孢霉菌、分支着色霉菌，镰袍菌则对其完全免疫。艾纳香(Blumea balsamifera),Blumea membranace及Blumea eriantha的挥发油也分别具有杀菌作用或可与别的草药配伍制成杀菌精油[3-5]。但迄今为止，关于壮药白花九里明的急性毒性和体内抗菌研究尚少见报道。笔者通过研究其水、醇提物的急性毒性和水提物的体内抗菌作用，旨在为进一步对其开发、临床应用及相关研究提供实验依据。

1 实验资料

1.1实验动物 健康SD小鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCKX桂2003-0001。饲养于空调室内，室温(22±2)℃，湿度(70±5)%，喂标准颗粒饲料，自由饮水和摄食。

1.2 菌株及仪器、试药 金黄色葡萄球菌ATCC25923、肺炎克雷伯菌ATCC13883由广西临床检验中心提供。METTLER-AE100电子分析天平，瑞士METTLER公司；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；101A-3E(T) 电热鼓风干燥箱，上海实验仪器有限公司；水浴锅，上海亚荣生化仪器厂。广西南宁市郊采集壮药白花九里明，经广西中医药大学宁小清高级实验师鉴定为菊科植物东风草的地上部分。壮药白花九里明水提物制备：剪碎阴干药材，加过面水浸泡30 min后煎煮3次， 每次1 h，过滤后合并3次滤液，浓缩至浓度为3 g/mL 水煎物，取3 g/mL水提物20 mL稀释为1 g/mL，备用，水提物提取率为12.3%。白花九里明醇提取物制备：把粗粉药材6.5 kg放入95%乙醇浸泡72 h后渗漉提取，收集约20倍量的渗漉液，减压回收乙醇；药渣再用50%乙醇浸泡72 h后渗漉提取，收集约10倍量的渗漉液，减压回收乙醇，合并干燥后得乙醇总提取物约750 g，备用，醇提物提取率为11.5%。实验时将其用水配置成所需要的浓度。头孢氨苄片(清远华能制药有限公司，批号：140201)，梅山干酵母粉(河北马利食品有限公司，批号：140628)。

1.3 实验方法

1.3.1 序贯法急性毒性实验 参照文献[6-7]方法。取雌雄SD小鼠各30只，按雌雄1∶1比例分为6组，每组10只，其中一组为空白对照组，其余倍量5组。通过预试验，找出最大致死量(Dm)和最小致死量(Dn)，根据预实验结果，药液各组日授时剂量为Dm/Dn值的2倍量、3倍量、4倍量、5倍量、10倍量,两相邻剂量组间的高低剂量比为1∶0.8，各小鼠均按0.4 mL/10 g分2次灌胃，2次间隔时间为6 h，空白对照组灌胃等量饮用水。灌胃前禁食不禁水15 h，间隔时间不给食，给药后常规饲养，观察小鼠体质量变化及外观、饮食、行为、排泄物、分泌物、中毒反应(症状表现、起始时间、程度、持续时间、是否可逆等)及死亡情况,观察14 d。对濒死和死亡的动物及时尸检,其他动物在观察期结束后尸检,观察内脏器官体积、颜色及质地,若有肉眼可见病变进行病理组织学检查。

1.3.2 感染动物保护实验 参照文献[8]方法。

1.3.2.1 预试验 把金黄色葡萄球菌ATCC25923、肺炎克雷伯菌ATCC13883分别接种到肉汤培养基中，培养24 h后配制成1.0×109cfu/mL菌液，5个菌液稀释组分别以5%干酵母肉汤5倍系列稀释菌液(稀释后浓度分别为2.0×108，4.0×107，8.0×106，1.6×106，3.2×105cfu/mL)4 ℃冷藏待用。各菌各选取体质量18～22 g小鼠36只 , 雌雄各半分为5个菌液稀释组和1个对照组,每组6只，对照组灌胃 5%干酵母肉汤0.5 mL/只，其余组灌胃相应药物0.5 mL/只 。观察染菌后3 d内动物的死亡情况 , 并选取感染病死率为90%～100%最小致死量作为正式实验的感染菌液浓度。预试结果:对照组无动物死亡,金黄色葡萄球菌ATCC25923菌落浓度8×106cfu/mL致死率为100%，肺炎克雷伯菌ATCC13883菌落浓度1.6×106cfu/mL致死率为90%,确定为本次实验感染的菌液浓度。

1.3.2.2 正式实验 各菌选取体质量为18～22 g健康SD小鼠60只,雌雄各半,分为5%干酵母肉汤组、头孢拉定组、生理盐水组、白花九里明水提物6.7 g/kg组、白花九里明水提物13.4 g/kg组、白花九里明水提物26.8 g/kg组，均灌胃给药，容量为20 mL/kg，1次/d，连续7 d,末次给药后1 h，后5组根据菌株毒力的预试情况分别选用使100%小鼠死亡的金黄色葡萄球菌(8×106cfu/mL)、90%小鼠死亡的肺炎克雷伯菌(1.6×106cfu/mL)的5%干酵母肉汤灌胃，0.5 mL/只,观察和记录各组小鼠感染后7 d内的一般情况和死亡数。

2 结 果

2.1急性毒性实验 壮药白花九里明水提物、醇提物灌胃后各组小鼠的主要中毒表现为呼吸困难或费力，喘息，用力深吸气有明显的吸气声，自发活动减少甚至不动；死亡动物死亡前有激烈的抽搐，抽搐后2～10 s内迅速死亡，抽搐时伴急速蹬后腿、肌肉紧张、颤动、呼吸困难，死前无排尿。死亡时间，醇提物均出现在给药后的40 min左右，水提物均出现在给药后的60 min左右，若这段时间内不死亡，将不会死亡，各种不适现象均逐渐消失，一切生理活动恢复正常。实验后，对死亡及存活的小鼠进行尸检，肉眼观察小鼠的肝、肾、心脏等未出现体积、颜色、质地等改变。说明壮药白花九里明提取物未见明显的内脏损伤毒性，但会对呼吸系统等有短时的毒性影响。按序贯法公式进行计算，结果壮药白花九里明水提物对小鼠灌胃的LD50为(134.17±9.043)g生药/kg，LD50的95%可信区间为(125.127，143.213)；壮药白花九里明醇提物对小鼠灌胃的LD50为(107.37±17.665)g生药/kg，LD50的95%可信区间为(89.705,125.035)。

2.2 金黄色葡萄球菌感染小鼠死亡、存活情况 生理盐水组动物病死率为100%，说明密度为8×106cfu/mL金黄色葡萄球菌的干酵母肉汤能明显引起小鼠死亡。头孢拉定组病死率显著低于生理盐水组(P<0.01)，且平均存活时间显著延长(P<0.01);白花九里明水提物各组病死率显著低于生理盐水组(P均<0.05)，平均存活时间较生理盐水组显著延长(P均<0.05)，且随剂量增加而病死率逐渐降低。见表1。

表1 各组金黄色葡萄球菌感染小鼠死亡、存活时间比较

注：①与生理盐水组比较，P<0.01；②与生理盐水组比较，P<0.05。

2.3 肺炎克雷伯菌感染小鼠死亡、存活情况 生理盐水组动物病死率为90%，说明密度为1.6×106cfu/mL肺炎克雷伯菌的干酵母肉汤能明显引起小鼠死亡。头孢拉定组病死率显著低于生理盐水组(P<0.01)，且平均存活时间显著延长(P<0.01);但白花九里明水提物各组病死率及平均存活时间与生理盐水组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组肺炎克雷伯菌感染小鼠死亡、存活时间比较

注：①与生理盐水组比较，P<0.01。

3 讨 论

细菌耐药性已成为世界性的难题，中药包括民族药呈现的抗菌作用越来越受到重视，开发和研究抗菌中药对解决耐药和抗菌药物短缺的问题具有重要意义。广西民间常用的壮药白花九里明具有清热解毒功效，治疗痈肿疮疖、皮肤瘙痒、产后出血继发细菌感染[9]等效果较好，但其体内抗菌的有效成分和作用机制等尚待进一步研究。

本实验结果表明，壮药白花九里明水提取物的LD50为(134.17±9.043)g生药/kg，95%可信区间为(125.127，143.213)；醇提取物LD50为(107.37±17.665)g生药/kg，95%可信区间为(89.705，125.035 )。提示壮药白花九里明提取物有轻度急性毒性，大剂量服用比较安全。壮药白花九里明醇提物与水提物中毒后动物死亡表现基本一致，提示2种不同溶剂提取物中导致死亡的主要成分基本相同。但醇提物的死亡时间明显短于水提物20 min左右，推断有可能为主要成分在不同提取溶剂富集程度有所不同。

本实验研究还显示壮药白花九里明水提取物对金黄色葡萄球菌有一定的体内抗菌作用，而对肺炎克雷伯菌基本无体内抗菌作用。这是由于G+菌与G-菌的细胞壁结构明显不同，这两类细菌在抗原性、致病性及对药物敏感性方面出现很大差别。G+菌细胞壁比较厚，由磷壁酸和肽聚糖组成，肽聚糖含量多达 50 层。G-菌细胞壁虽较薄，可结构较复杂，除含有1～2层的肽聚糖外，尚有外膜层位于肽聚糖层的外侧，这种屏障结构不仅使细菌不易受到人体的体液杀菌物质、肠道的胆盐及消化酶等的作用，还可阻止某些抗菌药物的进入。中药包括民族药的抑菌原理可能比较复杂，壮药白花九里明水提取物对金黄色葡萄球菌有不同程度的抑制作用，可能是因为破坏了细菌细胞壁的肽聚糖层致使结构遭受破坏，再通过破损的细胞壁进入细胞内部造成基质及细胞器的损坏；或是药物通过破损的细胞壁进入到细胞内，致细胞内的离子平衡失调，出现渗透压、pH值等改变从而损伤基质和细胞器，达到抑制细菌生长的作用。壮药白花九里明水提取物对肺炎克雷伯菌基本无体内抗菌作用，可能是由于两类细菌的结构和成分的差异使得药物有不同通透性，以及革兰阴性菌外膜的屏障结构，使得药物进入细菌细胞内受阻;有研究认为一般G+菌比G-菌对理化因子的敏感性要强[10]，本实验结果也显示，壮药白花九里明水提取物对G+菌的作用比较强，而对G-菌几乎无作用。

综上所述，壮药白花九里明提取物为低毒，大剂量服用比较安全；其对金黄色葡萄球菌感染的小鼠有一定的体内保护作用，但其具体机制还不明确，这一抗菌作用明显、用途广泛、分布广阔的植物资源，非常值得进一步深入研究和开发。

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Acute toxicity tests and in vitro antibacterial activity of the extracts from Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng

NING Tian1，HUANG Weizhen2，NING Xiaoqing3，LI Junfang3，LIANG Hong1，ZHANG Qing2, HUANG Yifei4

(1.Guangxi Health Vocational & Technical College, Nanning 530023, Guangxi, China; 2.Guangxi Maternal and Child Health Hospital, Nanning 530003, Guangxi, China; 3.Guangxi University of TCM, Nanning 530001, Guangxi, China; 4.Nanning Maternal and Child Health Hospital, Nanning 530002, Guangxi, China)

Objective It is to study the acute toxicity and bacteriostasis in vitro of extracts from the Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng. Methods Sequential method was used to determine the acute toxicity of aqueous extract and alcohol extract of Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng in mice. Infected animal protecting experiment was used to determine the extract on staphylococcus aureus, klebsiella pneumoniae infection in mice. Results The LD50 and 95% confidence interval of aqueous extract and alcohol extract to the Mice IG were(134.17±9.043)g material/kg, (125.127，143.213) and (107.37±17.665)g material/kg, (89.705，125.035) respectively. High(26.8 g/kg), medium(13.4 g/kg),low (6.7 g/kg)dose group of of the aqueous extract of Blumea megacephala (Randeria) chang et Tseng could all depress the death rate leng then the average survival time of mice in fected by Staphylococcus aureus. Conclusion The aqueous extract and alcohol extract of Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng is low toxicity， high doses of the aqueous extract of Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng have remarkable protecting effect on mice infected by Staphylococcus aureus, so it deserves further research and development.

Blumeu megucephala(Randeria) chamg et Tseng；acute toxicity; anti-bacterial effects in the body；antibacterial action

宁天，男，教授，研究方向为中药药理学。

黄维真，E-mail：ningyu747@163.com

广西卫生厅自筹经费科研课题(Z2013151)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.25.001

R-332

A

1008-8849(2015)25-2737-03

2015-04-05