PJ34对大鼠局灶性脑缺血再灌注脑组织MMP-9、Claudin-5表达的影响

吴捧莲，李岩，付新慧，杜良鹤，王东玉

（1.辽宁医学院研究生学院，辽宁 锦州 121001；2.辽宁省锦州市中心医院神经内科，辽宁 锦州 121000）

·论著·

PJ34对大鼠局灶性脑缺血再灌注脑组织MMP-9、Claudin-5表达的影响

吴捧莲1，李岩2，付新慧1，杜良鹤1，王东玉2

（1.辽宁医学院研究生学院，辽宁 锦州 121001；2.辽宁省锦州市中心医院神经内科，辽宁 锦州 121000）

目的探讨多聚ADP核糖聚合酶1（PARP-1）抑制剂PJ34对大鼠局灶性脑缺血再灌注后缺血侧皮层金属蛋白酶9（MMP-9）和Claudin-5表达的影响。方法采用线栓法制备大鼠局灶脑缺血再灌注模型，腹腔注射PJ34，用伊文思蓝（EB）法检测血脑屏障通透性变化，采用2，3，5-三氨基苯甲四氮唑（TTC）染色检测脑梗死体积变化，免疫组化和Western blot方法检测脑缺血侧皮层MMP-9和Claudin-5表达。结果与假手术组比较，随缺血再灌注时间延长，模型组MMP-9表达、EB含量、脑梗死体积逐渐增加，48 h达峰；Claudin-5的表达、EB含量、脑梗死体积逐渐减少，48 h最低（P均＜0.05）。与模型组比较，PJ34组MMP-9表达、EB含量、脑梗死体积在各个时间点明显降低，Claudin-5的表达、EB含量、脑梗死体积在各个时间点明显增高（P均＜0.05）。结论PJ34通过抑制MMP-9的表达，增加Claudin-5的表达来维持血脑屏障通透性，对脑缺血再灌注损伤有神经保护作用。

PJ34；金属蛋白酶9；Claudin-5；血脑屏障；缺血再灌注

PARP-1的抑制剂PJ34［N-（6-氧代-5，6二氢-菲-2-基）-N，N-二甲基乙酰胺］，为水溶性菲啶酮类化合物，主要通过竞争性阻断多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase-1，PARP-1）分子上NAD+结合位点发挥作用，在缺血再灌注损伤和帕金森病、癌症的动物模型中取得较好治疗效果［1］。PJ34对缺血再灌注损伤血脑屏障通透性的研究机制尚未完全清楚。近年研究表明金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）可以降解基底膜蛋白、层黏连蛋白、胶原蛋白和紧密连接蛋白（Claudin-5和occludin），破坏血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）通透性。

本实验研究建立在上述研究的基础上，采用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型，选用PJ34作为干预因素，观察PJ34对大鼠局灶脑缺血再灌注BBB通透性变化、缺血侧脑组织MMP-9、Claudin-5蛋白表达的影响，探讨PJ34减轻脑缺血再灌注损伤的机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

健康Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠120只，体质量250～300 g，由辽宁医学院实验动物中心提供（动物许可证号：SCXK［辽］2010-0001）。随机均分为3组：假手术组、模型组、PJ34组。各组分别在缺血再灌注24 h、48 h取材。PJ34组在缺血再灌注时及再灌注后2 h分别给予PJ34（10 mg/kg），假手术组、模型组在相同时间点给予等量生理盐水。PJ34购自Selleck.cn公司；兔抗鼠MMP-9多克隆抗体、生物素标记羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗鼠Claudin-5多克隆抗体购自北京博奥森生物工程有限公司。

1.2 大鼠局灶性大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型制备

参照Longa等［2］的实验方法，制作大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注模型。采用直径2 mm的鱼线，长约5.8 cm，一端用酒精灯稍加热使鱼线头部直径约为0.25～0.28 mm，备用。大鼠10%水合氯醛（300 mg/kg，腹腔注射）麻醉后，固定，消毒，颈部正中切口，分离颈总动脉和颈内、外动脉，勿损伤迷走神经，于颈总动脉近心端、颈外动脉根部结扎，在颈总动脉分叉近心端处剪一小口，插入鱼线，进线（1.8±0.5）cm，感到有阻力时，即栓线到达大脑中动脉起始处及大脑前动脉近心端，从而阻断大脑中动脉血流，结扎固定鱼线。缝合筋膜、皮肤。栓塞2 h后使血流再通。假手术组手术过程与模型组相同，不插鱼线。大鼠麻醉后约2 h开始苏醒，于再灌注时判断其神经功能缺损情况，按照longa评分法［3］进行评分。评分1～3分纳入实验动物，0分、4分剔除，符合评分但有蛛网膜下腔出血、术后死亡作为缺失值剔除，在后续实验中补足，术后保持环境温度25～30℃。

1.3 伊文思蓝（Evans blue，EB）BBB通透性测定

每亚组随机抽取5只大鼠，在取脑前30 min经尾静脉注射2%EB。麻醉后用肝素化生理盐水心脏灌流至右心房流出液体为清亮。各个时间点取脑组织，称重，置于甲酰胺中（100 mg/mL），45℃水浴24 h，离心取上清液。分光光度计波长为620 mm测定上清液吸光度（optical density，OD）值，脑组织EB含量计算公式：脑组织EB含量（μg/g）=待测样品EB含量（μg/mL）×甲酰胺溶液（mL）/脑湿重（g），待测样品EB含量是根据标准曲线回归方程求得。

1.4 脑梗死体积测定（TTC染色法）

每亚组随机抽取5只大鼠，断头取脑，快速经枕骨大孔取出脑组织，洗净脑组织，-20℃冰箱速冻30 min。脑组织从额极向后以2 mm间距冠状切成5片。脑片置于37℃水浴箱避光染色15～30 min，注意中间翻片使切片均匀接触染色液，10%多聚甲醛中固定。鼠脑切片用数码相机拍照，用眼科镊分离白色区与红色区，分别称重，以梗死组织重量占缺血侧脑组织重量的百分比作为梗死体积的判定标准。

1.5 免疫组化染色检测MMP-9、Claudin-5在脑组织的表达

每亚组随机抽取5只大鼠10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，快速打开胸腔，经左心室穿刺插管入主动脉，灌注4℃生理盐水250 mL，同时剪开右心耳，4%多聚甲醛250 mL缓慢灌注至液体清亮断头取脑，固定液中保存。常规脱水、浸蜡、包埋，连续冠状切片，操作按试剂盒说明书进行MMP-9、Claudin-5免疫组化染色。切片染色后每个样本选取5张切片，每张切片于400倍光镜下系统随机选取3个视野进行检测，计算平均积分光密度值（mean oprieal density，MOD）。图像分析MMP-9、Claudin-5在脑组织额顶叶皮层的表达，用Image-ProPlus 6.0图像分析系统对免疫组化结果进行图像分析。

1.6 Western blot检测MMP-9、Claudin-5在脑组织的表达

每亚组随机抽取5只大鼠，断头取脑，冰上迅速分离额顶叶皮层，放入EP管中，-80℃冰箱保存。组织标本加入适量裂解液，进行超声波粉碎，低温离心取上清液。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度定量，沸水煮5 min，离心备用。制备分离胶和浓缩胶，加样，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，加一抗：兔抗大鼠多克隆MMP-9抗体（1∶300）和Claudin-5（1∶300）4℃孵育过夜，TBST漂洗，5 min× 3次，加二抗（山羊抗兔IgG，1∶3 000）孵育2 h。TBST漂洗，5 min×3次，ECL发光，X线曝光、显影、定影，计算机图像分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 PJ34对血脑屏障通透性的影响

用EB法检测血脑屏障通透性，EB含量变化来评价血脑屏障通透性变化。与假手术组比较，模型组与PJ34组均明显增高（P＜0.05），EB含量在再灌注后48 h达峰。与模型组比较，PJ34组能降低血脑屏障的破坏，使EB含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 PJ34对大鼠EB含量的影响（μg/g湿重）Tab.1 Influence of PJ34 on EB content in rats（μ g/g wet weight）

2.2 梗死体积百分比测定

用TTC染色法检测脑梗死体积。与假手术组比较，模型组与PJ34组均明显增高（P＜0.05），脑梗死体积在再灌注后48 h达峰。与模型组比较，PJ34组脑梗死体积明显降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表2。

表2 大鼠脑梗死体积百分比比较（%）Tab.2 Comparison of the percentage of infarct volume in rats（%）

2.3 MMP-9和Claudin-5的分布和表达

免疫组化结果显示，MMP-9在缺血侧额顶叶皮层胞质中呈棕褐色或棕黄色阳性表达。与假手术组比较，模型组、PJ34组MMP-9的MOD值在再灌注后24 h增加，48 h达高峰，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，PJ34组MMP-9的MOD值在再灌注后减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3、图1。Claudin-5在缺血侧额顶叶皮层中沿微血管内皮细胞呈棕褐色或棕黄色表达。与假手术组比较，模型组和PJ34组Claudin-5在再灌注后24 h MOD值降低，48 h MOD值降低最明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，PJ34组Claudin-5在再灌注后MOD值均高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3、图2。

图1 免疫组化法检测大鼠缺血侧皮层MMP-9的表达 ×400Fig.1 Expressions of MMP-9 measured by immunohistochemistry assay in the ischemic cerebral cortex of rats×400

表3 各组大鼠不同时间点免疫组化法检测MMP-9蛋白和Claudin-5蛋白的MOD值比较Tab.3 Comparison of the MOD values of MMP-9 and Claudin-5 protein in each group at different time points in rats by Immunohistochemistry

图2 免疫组化法检测缺血侧微血管内皮细胞中Claudin-5的表达 ×400Fig.2 Expressions of claudin-5 measured by immunohistochemistry assay in the ischemic brain microvessel endothelial cells of rats ×400

2.4 Claudin-5和MMP-9蛋白的表达

采用Western blot法进一步证实假手术组、模型组和PJ34组中Claudin-5和MMP-9蛋白表达的影响。与假手术组比较，模型组出现MMP-9特异性条带，24 h增高，48 h达峰；与模型组比较，PJ34组 MMP-9特异性条带均减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。与假手术组比较，模型组Claudin-5特异性条带24 h降低，48 h降低最明显；与模型组比较，PJ34组Claudin-5特异性条带均增强，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4、图3。

表4 各组大鼠不同时间点MMP-9蛋白和Claudin-5蛋白相对含量的比较（%）Tab.4 Comparison of the relative content of MMP-9 and Claudin-5 protein in each group at different time points in rats by Western blot（%）

图3 Western blot法检测缺血侧皮层MMP-9、Claudin-5的表达Fig.3 The expressions of MMP-9 and Claudin-5 were measured by Western blot analysis in the ischemic cerebral cortex of rats

3 讨论

PARP-1抑制剂在心脑血管疾病、癌症、内分泌疾病和炎症中的作用已经成为全球研究和关注的热点，但较少见其对血脑屏障通透性方面的研究报道。本实验主要观察了PARP-1抑制剂PJ34对MMP-9、Claudin-5在脑缺血再灌注损伤中表达的影响，旨在探讨PJ34对血脑屏障通透性影响的研究机制。

PARP-1是一种DNA损伤效应酶，主要分布细胞核内，对DNA损伤修复起重要作用。当机体发生DNA损伤、氧化应激反应时，PARP-1被激活，应用PARP-1抑制剂PJ34，可以抑制PARP-1的表达，能充分恢复ATP水平，减少神经细胞死亡，对机体产生保护作用［4］。研究表明在大鼠局灶脑缺血再灌注损伤中，PJ34干预使肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表达减少，降低TNF-α对MMP-9mRNA合成的诱导，从而降低MMP-9的表达［5，6］。Koh等［7］通过研究PARP抑制剂3-氨基苯甲酰胺（3-aminobenzamide，3-AB）的治疗效果，PARP抑制剂3-AB治疗组各时间点血浆及脑内MMP-9的水平、核转录因子kB（nuclear factor-kappa B，NF-kB）的活性显著减少。TNF-α通过NF-kB基因的转录位点，诱导MMP-3的表达，MMP-3能激活MMP-9。本实验研究结果与上述研究结果一致，在脑缺血再灌注损伤24 h时，MMP-9表达明显升高，48 h时达高峰，PJ34干预脑缺血再灌注后，缺血侧皮层MMP-9的活性降低、表达减少，梗死体积减少，神经缺损有所改善。

脑缺血再灌注后激活的胶质细胞、神经元及浸润的中性粒细胞均能释放MMP-9，MMP-9可以攻击脑毛细血管基底膜和紧密连接（tight junction，TJ）蛋白，导致白细胞浸润、血脑屏障开放、血管源性水肿、缺血后出血性转化［8］。Claudin-5是构成TJ蛋白的骨架蛋白，是决定TJ蛋白屏障通透性的主要蛋白，维护大鼠的BBB完整性。TJ蛋白和细胞外基质构成脑和血液之间物质交换的第一道屏障，BBB是维持中枢神经系统内环境稳定的关键。因此，MMP-9可以降解Claudin-5蛋白。研究表明在大鼠缺血再灌注损伤模型组，MMP-9表达升高，Claudin-5表达减少，PARP抑制剂3-AB（10 mg/kg）治疗组显著上调Claudin-5的蛋白表达［9］。再灌注损伤中血脑屏障通透性破坏的一个重要机制是MMP-9降解Claudin-5［10，11］。本研究结果与上述研究结果相一致，应用PJ34干预后MMP-9表达减少，Claudin-5表达增加。MMP-9和Claudin-5在调节血脑屏障通透性和血管内皮细胞完整性中起重要作用［12］。大鼠脑缺血损伤后，MMP-9被激活，激活的MMP-9通过降解Claudin-5，增加血脑屏障通透性。应用MMP-9抑制剂后，Claudin-5表达下调，血脑屏障通透性减少［13］。MMP-9降解Claudin-5的机制可能为：缺血再灌注损伤使炎性因子增加，导致NF-kB磷酸化，NF-kB的激活能上调MMP-9的表达［14］。Claudin-5的降解和血脑屏障通透性增加是MMP-9通过NF-kB/MMP-9信号转导通路来实现的。本研究也提示，在脑缺血再灌注后，MMP-9的表达下降可以增加Claudin-5的表达。

本研究采用大脑中动脉栓塞制备局灶脑缺血再灌注模型，在缺血再灌注后24 h，MMP-9的表达增加，Claudin-5的表达减少，血脑屏障通透性增加，梗死体积增加。在48 h时间点MMP-9的表达达峰，Claudin-5的表达最低，血脑屏障通透性达峰，脑梗死体积进一步增加，表明MMP-9参与血脑屏障的破坏，Claudin-5对血脑屏障有保护作用。应用PJ34干预后，MMP-9的表达减少，Claudin-5的表达增加，从而改善血脑屏障通透性，减少梗死体积，减少缺血再灌注后神经功能缺损。

综上所述，PJ34通过降低MMP-9的表达，减少Claudin-5的降解，使Claudin-5的表达增加，改善血脑屏障通透性，对神经系统损伤产生保护作用。

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（编辑 武玉欣）

Influence of PJ34 on the Expression ofMMP-9 and Claudin-5 in Ratwith FocalCerebral Ischemia Reperfusion Injury

WUPeng-lian1，LIYan2，FUXin-hui1，DU Liang-he1，WANG Dong-yu2
（1.Graduate SchoolofLiaoning MedicalUniversity，Jinzhou 121001，China；2.DepartmentofNeurology，Jinzhou CentralHospital，Jinzhou 121000，China）

Objective To investigate the effectsofPJ34，a poly ADP-ribose polymerase（PARP）inhibitor，on the expression ofmatrix metalloproteinases-9（MMP-9）and Claudin-5 in ischemic cortex of rats with focal cerebral ischemia-reperfusion（I/R）injury.MethodsThe focal cerebral ischemia-reperfusion model of middle cerebral artery occlusion（MCAO）was established by intraluminal suture.PJ34 was injected intraperitoneally.Blood-brain barrier（BBB）permeability was quantitatively determined by Evansblue assay.Infarctvolume changes were observed by 2，3，5-triphenyltetrazolium chloridedyeing（TTC）staining.The expression ofthe MMP-9 and Claudin-5 in rats ofcerebralcortex were measured by immunohistochemistry assay and Western blotanalysis.ResultsCompared with sham group，the expression ofMMP-9，the contents ofEB and infarctvolume increased progressively over time after I/R，and reached maximum levels at 48 h（P＜0.05）；The expression of Claudin-5，the contents of EB and infarct volume reduced significantly over time after I/R，and reached the minimum levels at 48 h in model group（P＜0.05）.Compared with model group，the expression of MMP-9，the contents of EB and infarct volume was reduced significantly and the expression of Claudin-5，the contents ofEB and infarctvolume was increased atthe same time pointin PJ34 group（P＜0.05）.ConclusionPJ34 maintained the blood-brain barrierpermeability by inhibiting the expression ofMMP-9，and increasing the expression ofClaudin-5，which had neuroprotection on cerebralischemiareperfusion injury.

PJ34；matrix metalloproteinases-9；Claudin-5；blood-brain barrier；ischemia-reperfusion

R743.3

A

0258-4646（2015）08-0694-05

辽宁省自然科学基金（201102074）

吴捧莲（1988-），女，硕士研究生.

王东玉，E-mail：1448219167@qq.com

2015-02-24

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