1，25-二羟基维生素D3在小鼠肺脏液体清除中的作用

葛鑫，崔湧，丁炎，刘兵，吴思慧，聂宏光

（中国医科大学1.代谢病分子机制与药物研究所，沈阳 110122；2.附属第一医院麻醉科，沈阳 110001）

·论著·

1，25-二羟基维生素D3在小鼠肺脏液体清除中的作用

葛鑫1，崔湧2，丁炎1，刘兵1，吴思慧1，聂宏光1

（中国医科大学1.代谢病分子机制与药物研究所，沈阳 110122；2.附属第一医院麻醉科，沈阳 110001）

目的探讨1，25-二羟基维生素D3（1，25-VD3）与在体小鼠肺泡液体清除率（AFC）之间的关系，以明确其在肺脏液体清除中的作用机制。方法维生素D处理组雄性昆明小鼠用活性维生素D类似物帕立骨化醇腹腔注射2周，应用酶标仪测定小牛血清白蛋白浓度的方法测定小鼠在体AFC。用Western blot方法测定小鼠肺组织的上皮钠通道蛋白表达水平。结果维生素D处理组小鼠AFC为（31.9±3.8）%，对照组为（19.7±1.9）%（P＜0.05）。阿米洛利敏感性AFC与对照组相比增加了50%。Western blot结果显示维生素D处理组小鼠肺组织α-上皮钠通道蛋白表达水平明显提高。结论维生素D能够增加小鼠AFC，其机制可能与增加上皮钠通道蛋白表达有关。临床上应用维生素D治疗可能会有利于减轻患者的肺水肿。

维生素D；肺水肿；肺泡液体清除率；上皮钠通道

目前认为，肺泡液体清除率（alveolar fluid clearance，AFC）对肺脏生理和病理状态下的液体平衡，如急性肺损伤和成人呼吸窘迫症，均起重要的调控作用。增加AFC能加速肺水肿的恢复，改善肺泡上皮的气体交换。相反，减少AFC能降低急性肺损伤和成人呼吸窘迫症患者的生存率，导致肺水肿的发生［1］。其中肺泡上皮钠通道在AFC中扮演关键角色。

1，25-二羟基维生素D3（1，25-VD3）是维生素D的生物活性代谢产物，除了调节钙和磷的代谢外，还具有其他的生物活性。目前认为维生素D参与哮喘、急性肺损伤和慢性阻塞性肺疾病等呼吸疾病的病理过程，能够降低血管通透性，减轻肺水肿等肺损伤过程［2～4］。因而推测1，25-VD3可能通过改变上皮钠通道活性，在肺脏液体清除中发挥保护作用。

本研究拟探讨1，25-VD3与在体小鼠AFC之间的关系，旨在明确其是否通过改变肺泡上皮Na+转运参与其对AFC的调控作用，从而在肺脏液体清除中发挥可能的保护作用。

1 材料与方法

1.1 在体小鼠AFC测定

采用健康雄性昆明小鼠，8～10周龄，体质量20～30 g，由中国医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（辽）2008-0005。AFC计算方法参照相关文献［5］。模型组小鼠腹腔注射200 ng·kg-1·d-1帕立骨化醇（活性维生素D）［6］2周，对照组小鼠腹腔注射等剂量丙二醇（有机溶剂）2周。使用10%水合氯醛0.4 mL/100 g腹腔麻醉后，钝性分离气管。所有小鼠采用完全随机方法分为4组：经气管插管注入0.3 mL用0.9%生理盐水配制的等渗5%小牛血清白蛋白于对照组小鼠或模型组小鼠（VD组）；气管内注入0.3 mL含有上述5%小牛血清白蛋白的1 mmol/L阿米洛利于对照组小鼠（阿米洛利处理组，Amil组）或模型组小鼠（VD+Amil组）。通过容量控制的小动物呼吸机（HX-300，成都泰盟科技有限公司）给予麻醉小鼠100%O2通气30 min，然后用1 mL注射器经气管插管缓慢负压吸取肺泡内液体。用96孔板通过Anthos 2010全自动定量酶标仪（郑州安图生物工程有限公司）检测肺泡液体内小牛血清白蛋白的浓度。AFC计算公式如下：AFC（%）=［（Vi-Vf）/Vi］× 100，其中Vf=Vi×Pi/Pf，式中Vi和Vf分别代表起始注入肺泡内（i）和灌注30 min后吸出的肺泡液（f）液体体积，P是白蛋白浓度。上述试剂均购于美国Sigma公司。

1.2 Western blot分析

分别提取上述模型组小鼠（腹腔注射200 ng·kg-1·d-1帕立骨化醇—活性维生素D，2周）及对照组（腹腔注射等剂量丙二醇有机溶剂，2周）适量的肺组织，加入蛋白裂解液冰上匀浆，离心收集上清，定量，煮沸15 min，应用10%凝胶进行SDS-PAGE分析。在TBST溶解的5%无脂肪冻干奶粉溶液中孵育1 h后，加入一抗，4°C过夜。二抗室温孵育60 min。每次抗体反应后用缓冲液TBST冲洗3次，每次15 min。本实验所用抗体购自Abcam公司，抗体的稀释浓度为1∶1 000。应用ECL试剂盒（Thermo，SuperSignal），并分析图像。

1.3 统计学分析

2 结果

如图1所示：与对照组相比，VD组小鼠AFC［（31.9±3.8）%］明显高于对照组［（19.7±1.9）%］，（n=5，P＜0.05）。上皮钠通道特异性阻断剂阿米洛利能明显降低AFC，Amil组与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。VD+Amil组AFC也明显降低，与单独应用维生素D处理的VD组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。VD组阿米洛利敏感性AFC（用总AFC减去应用阿米洛利之后的AFC，此部分与上皮钠通道的活性相关）与对照组相比增加了50%。表明维生素D能够增加在体小鼠肺脏液体清除，推测与其增强上皮钠通道活性相关。

图1 维生素D对在体小鼠肺泡液体清除率的影响Fig.1 Influence of vitamin D on alveolar fluid clearance in mice

为了进一步明确上述维生素D增加在体小鼠肺脏液体清除的作用是否与阿米洛利敏感的上皮钠通道的表达有关，应用Western blot方法比较了上皮钠通道α亚单位在上述对照组与模型组小鼠肺脏中的表达情况。如图2所示：VD组小鼠肺组织α-上皮钠通道蛋白表达水平有所升高（P＜0.05）。

3 讨论

维生素D除了参与钙磷代谢外，与水肿性疾病也有相关性。Sprinchorn等［7］曾报道了由于维生素D缺乏导致的足和踝关节骨髓水肿，应用维生素D治疗对于这类水肿性疾病有效［8］。肺水肿曾见于维生素D缺乏性低钙血症相关的左心室功能障碍［9］。目前认为AFC在维持肺泡腔干燥方面发挥着重要作用［10］。有关维生素D对肺脏AFC的研究数据非常有限，研究维生素D与AFC之间的关系非常必要。

图2 维生素D对小鼠肺组织上皮钠通道表达的影响Fig.2 Effects of vitamin D on epithelial sodium channel protein expression in mouse lungs

上皮钠通道是Na+通过极化上皮细胞顶侧膜的主要通路，肺泡腔内Na+由肺泡Ⅱ型上皮细胞顶膜的上皮钠通道进入细胞，再由位于基底膜侧的Na+-K+-ATP酶主动排出，同时伴随水的被动吸收［11］。由于Na+的转运是肺泡液体清除的重要驱动力，肺泡上皮钠通道在肺脏液体清除中扮演关键角色，推测维生素D可能通过影响位于细胞顶膜侧的阿米洛利敏感性上皮钠通道改变AFC。帕立骨化醇是一种活性维生素D，本研究中，维生素D处理能够增加在体小鼠AFC，阿米洛利敏感性AFC与对照组相比增加了50%。证实1，25-VD3能够增加小鼠AFC，与其增强上皮钠通道活性有关。

上皮钠通道目前已被克隆并研究，至今已克隆出5种上皮钠通道亚单位，分别命名为α-，β-，γ-，δ-和ε-上皮钠通道［12］。哺乳动物中有前4种亚单位的表达，其中α-亚单位为其主要的功能亚单位。本研究中，Western blot结果显示维生素D处理组（VD组）小鼠肺组织α-上皮钠通道蛋白表达水平明显提高，表明1，25-VD3增加小鼠AFC的机制可能与增加上皮钠通道蛋白表达有关。本研究结果对于临床上应用维生素D治疗患者肺水肿的可能性提供了理论基础。

［1］Matthay MA，Robriquet L，Fang X.Alveolar epithelium：role in lung fluid balance and acute lung injury［J］.Proc Am Thorac Soc，2005，2（3）：206-213.

［2］Zhang M，Dong M，Liu W，et al.1α，25-dihydroxyvitamin D3ameliorates seawater aspiration-induced acute lung injury via NF-κB and RhoA/Rho kinase pathways［J］.PloS One，2014，9（8）：e104507.

［3］Chen SF，Ruan YJ.1α，25-dihydroxyvitamin D3decreases scaldingand platelet-activating factor-induced high vascular permeability and tissue oedema［J］.Pharmacol Toxicol，1995，76（6）：365-367.

［4］Malinovschi A，Masoero M，Bellocchia M，et al.Severe vitamin D deficiency is associated with frequent exacerbations and hospitalization in COPD patients［J］.Respir Res，2014，15（1）：131.

［5］Wang Q，Zheng X，Cheng Y，et al.Resolvin D1 stimulates alveolar fluid clearance through alveolar epithelial sodium channel，Na，KATPase via ALX/cAMP/PI3K pathway in lipopolysaccharideinduced acute lung injury［J］.J Immunol，2014，192（8）：3765-3777.

［6］Bellasi A，Galassi A，Salvi P，et al.Paricalcitol and cardiorenal outcome：from the IMPACT study to clinical practice［J］.Blood Purif，2013，36（1）：12-16.

［7］Sprinchorn AE，O'Sullivan R，Beischer AD.Transient bone marrow edema of the foot and ankle and its association with reduced systemic bone mineral density［J］.Foot Ankle Int，2011，32（5）：S508-S512.

［8］Simon MJ，Barvencik F，Luttke M，et al.Intravenous bisphosphonates and vitamin D in the treatment of bone marrow oedema in professional athletes［J］.Injury，2014，45（6）：981-987.

［9］Kazmi AS，Wall BM.Reversible congestive heart failure related to profound hypocalcemia secondary to hypoparathyroidism［J］.Am J Med Sci，2007，333（4）：226-229.

［10］Matalon S，Benos DJ，Jackson RM.Biophysical and molecular properties of amiloride-inhibitable Na+channels in alveolar epithelial cells［J］.Am J Physiol，1996，271（1 Pt 1）：L1-L22.

［11］Rossier BC，Baker ME，Studer RA.Epithelial sodium transport and its control by aldosterone：the story of our internal environment revisited［J］.Physiol Rev，2015，95（1）：297-340.

［12］Nie HG，Tucker T，Su XF，et al.Expression and regulation of epithelial Na+channels by nucleotides in pleural mesothelial cells［J］. Am J Respir Cell Mol Biol，2009，40（5）：543-554.

（编辑 王又冬）

Effectsof1，25-Dihydroxyvitamin D3on Alveolar Fluid Clearance in Mice

GE Xin1，CUIYong2，DINGYan1，LIUBing1，WUSi-hui1，NIE Hong-guang1

（1.Institute of Metabolic Disease Research and Drug Development，China Medical University，Shenyang 110122，China；2.Department of Anesthesiology，The First Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

Objective To explore the relationship between 1，25-dihydroxyvitamin D3（1，25-VD3）and alveolar fluid clearance（AFC）in mice in vivo，and investigate its effects in the process oflung fluid clearance.MethodsKMmale mice were treated with active vitamin D analogue paricalcitol（daily i.p.injection）for 2 weeks，and then the in vivo AFC of these mice was measured by bovine serum albumin protein assays.Western blot was applied to determine epithelialsodium channelprotein levelsin lungs ofthese mice.ResultsIn vivo totalAFC was 31.9%±3.8%in vitamin D-treated mice，and significantly lower in the vehicle-treated controls（19.7%±1.9%，P＜0.05）.Amiloride-sensitive AFC was increased approximately 50%by vitamin D.Western blot showed that the expression of α-epithelial sodium channel was significantly elevated in paricalcitol-treated mouse lungs.ConclusionThese observations suggest that vitamin D augments AFC in mice，which may be related to the augment of epithelial sodium channelprotein expression.The clinicalapplication ofvitamin D therapy may ameliorate pulmonary edema ofpatients.

vitamin D；pulmonary edema；alveolar fluid clearance；epithelial sodium channel

R541.6

A

0258-4646（2015）08-0679-03

国家自然科学基金（81270098）；辽宁省自然科学基金（2014021093）

葛鑫（1986-），女，助理实验师，硕士.

聂宏光，E-mail：niehg@hotmail.com

2015-01-30

网络出版时间：